吳彩鳳，戴建軍，鈕瑩芳，張樹山，陳亞寧，張德福

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106）

豬M II期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的凋亡途徑研究

吳彩鳳，戴建軍*，鈕瑩芳，張樹山，陳亞寧，張德福*

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106）

為闡明豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的細(xì)胞凋亡模式，本試驗利用原位熒光染色技術(shù)對凍后卵母細(xì)胞死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑中的Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和總Caspase活性進(jìn)行檢測，用RT-PCR技術(shù)對不同途徑中關(guān)鍵基因進(jìn)行mRNA表達(dá)檢測。結(jié)果顯示：豬MII期卵母細(xì)胞冷凍后，死亡受體外源性凋亡途徑的Caspase 8熒光強(qiáng)度值（32.03）和線粒體內(nèi)源性凋亡途徑的Caspase 9熒光強(qiáng)度值（16.56），以及兩者共同途徑中的Caspase 3和總Caspase熒光強(qiáng)度值（16.70和8.43）均顯著高于新鮮卵母細(xì)胞對照組所對應(yīng)的熒光強(qiáng)度值（分別為4.02、4.83、4.23和3.08）。死亡受體外源性凋亡途徑TNFα、FɑsL、CASP8和CASP3基因表達(dá)量也均有一定水平的提高，線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑中CASP9、CASP3和P53基因表達(dá)水平呈上升趨勢，而Bcl2、BAX、SOD1和survivin的基因表達(dá)水平顯著下降。綜上所述，死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡共同參與了豬MII期卵母細(xì)胞凍后的凋亡過程。

豬；卵母細(xì)胞；玻璃化；細(xì)胞凋亡

卵母細(xì)胞冷凍保存可使其利用不受時間和空間的限制，最大限度提高卵母細(xì)胞的綜合利用效率。然而由于豬卵母細(xì)胞脂肪含量高，對低溫敏感等因素，導(dǎo)致其產(chǎn)生冷凍損傷［1-2］。在冷凍保存中，卵母細(xì)胞和胚胎的退化也初步被認(rèn)為是由細(xì)胞凋亡過速引起的［3-5］。然而，目前關(guān)于豬卵母細(xì)胞的損傷機(jī)理的研究還很少。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定條件下接受刺激信號并受基因調(diào)控的一種自主性、程序性死亡過程［6］。死亡受體外源性凋亡途徑和線粒體內(nèi)源性凋亡途徑是哺乳動物細(xì)胞凋亡的兩個主要途徑，也是卵母細(xì)胞和胚胎早期發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡的主要途徑［7］。然而關(guān)于冷凍影響卵母細(xì)胞和胚胎凋亡途徑的研究還很少。

本研究對豬MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍解凍，并利用原位熒光染色的方法，對解凍后卵母細(xì)胞中線粒體內(nèi)源性凋亡途徑和死亡受體外源性凋亡途徑中的Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和總Caspase水平進(jìn)行檢測，利用熒光定量PCR技術(shù)，檢測線粒體內(nèi)源性凋亡途徑和死亡受體外源性凋亡途徑中的關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平，從而初步判斷凍后豬卵母細(xì)胞的可能凋亡途徑，為日后進(jìn)一步提高豬卵母細(xì)胞冷凍效率提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

除特別說明外，所有化學(xué)試劑均購自Sigma公司，培養(yǎng)液和血清購自Gibco公司。玻璃化冷凍所用的OPS（Open Pulled Straw）管由本實驗室自制，其由常規(guī)0.25 mL麥管拉長拉細(xì)而獲得。

1.2 方法

1.2.1 豬卵母細(xì)胞體外成熟

豬卵巢采集于上海五豐上食有限公司屠宰場，置于38.5℃的生理鹽水中1 h內(nèi)運(yùn)回實驗室。使用18號針頭注射器采集卵巢表面2—6 mm卵泡中卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體。選擇至少包裹3層顆粒細(xì)胞，且胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞用于成熟培養(yǎng)，每65枚卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體于500μL成熟培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：38.5℃44 h，飽和適度。成熟培養(yǎng)后用0.1%的透明質(zhì)酸酶消化以去除卵丘細(xì)胞，選擇胞質(zhì)均勻，且排除第一極體的成熟卵母細(xì)胞用于后續(xù)試驗。

1.2.2 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍和解凍

玻璃化冷凍時，卵母細(xì)胞先在冷凍平衡液（TCM199＋7.5%DMSO＋7.5%EG＋20%FBS）中處理5 min，再以微量體積移入玻璃化冷凍液（TCM199＋15%DMSO＋15%EG＋20%FBS＋0.5 mol/L蔗糖）中，15 s后開始用OPS管裝載卵母細(xì)胞，30 s內(nèi)投入液氮中冷凍保存。

解凍時，從液氮中取出OPS管，迅速投入38.5℃預(yù)熱的0.5 mol/L蔗糖溶液中，使卵母細(xì)胞流出，5 min后移入0.25 mol/L的蔗糖溶液中，作用5 min，用TCM199洗滌3次，放入事先在CO2培養(yǎng)箱中平衡的卵母細(xì)胞恢復(fù)液（TCM199＋10%FBS）中恢復(fù)2 h，選擇形態(tài)正常的解凍卵母細(xì)胞用于后續(xù)試驗。

1.2.3 卵母細(xì)胞Caspase原位熒光檢測

Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9原位熒光染色試劑盒購于碧云天（BioVision，中國），參照說明書，使用前先將各自用FITC標(biāo)記的抑制劑用清洗緩沖液進(jìn)行1∶300稀釋，然后將卵母細(xì)胞移入染色液中，37℃孵育15 min后用清洗緩沖液洗滌2次，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。總Caspase原位熒光染色試劑盒購于BioVision（美國）公司，將FITC-VAD-FMK用TCM199稀釋至10μmol/L，卵母細(xì)胞染色15 min后用TCM199洗滌2次，然后在熒光顯微鏡下觀察拍照。熒光照片是用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行量化，記錄其熒光信號強(qiáng)度值，結(jié)果用熒光平均相對密度表示。

1.2.4 卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的RT-PCR檢測

每150枚豬MII期卵母細(xì)胞用于1次RNA提取?？俁NA提取采用TIANGEN的RNApreo Pure微量樣品總RNA提取試劑盒進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄使用TIANGEN的FastQuant RT kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒.

RT-PCR操作時，從NCBI中獲得豬腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNFα）、Fas配體（Fas ligand，F(xiàn)ɑsL）、CASP8、CAS9、CASP3、Bcl2、BAX、SOD1、P53和survivin基因的cDNA序列并設(shè)計引物，GAPDH作為內(nèi)參基因。引物信息如表1所示。使用TAKARA的SYBR Premix Ex TaqTM II kit試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測。反應(yīng)體系為20μL，包括：cDNA模板2.0μL、SYBR Premix Ex Taq II 10μL、Forward Primer 0.8μL、Reverse Primer 0.8μL、ROX II0.4μL和加RNase-Free ddH2O補(bǔ)至20μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s，變性95℃5 s，退火34 s（Tm均為55℃），72℃延伸30 s，循環(huán)35次，退火處收集熒光。在ABI7500實時熒光定量PCR儀上運(yùn)行，每個樣品重復(fù)3次?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量采用2－△△Ct法計算比較［7］。

表1 RT-PCR引物信息Table 1 Primer information for RT-PCR

1.2.5 生物統(tǒng)計

測定結(jié)果采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05作為差異顯著評判標(biāo)準(zhǔn)，以*表示。RT-PCR以GAPDH為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPS冷凍對豬M II期卵母細(xì)胞多種Caspase水平的影響

本試驗分別利用Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和總Caspase原位免疫熒光染色試劑，分別對死亡受體外源性凋亡途徑中的Caspase 8、線粒體內(nèi)源性凋亡途徑中的Caspase 9，以及兩者共同作用途徑中的Caspase 3與總Caspase進(jìn)行原位熒光染色。結(jié)果如圖1所示：無論是Caspase 8、Caspase 9，還是兩者共同作用中的Caspase 3和總Caspase，冷凍后卵母細(xì)胞的原位熒光強(qiáng)度均顯著高于未冷凍的新鮮組。

圖1 新鮮和冷凍卵母細(xì)胞不同Caspase的原位熒光染色Fig.1 Cspases’in situ fluorescence stainings of fresh and vitrified porcine oocytes

所獲得的卵母細(xì)胞熒光圖片采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行量化，結(jié)果如表2所示。OPS冷凍保存后，死亡受體外源性凋亡途徑中的Caspase 8的熒光強(qiáng)度值（32.03），線粒體內(nèi)源性凋亡途徑中的Caspase 9的熒光強(qiáng)度值（16.56），兩者共同途徑中的Caspase 3和總Caspase的熒光強(qiáng)度值（16.70和8.43）均顯著高于對照組新鮮卵母細(xì)胞所對應(yīng)的熒光強(qiáng)度值（4.02，4.83，4.23和3.08，P＜0.05）。提示死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑可能均參與了凍后卵母細(xì)胞的凋亡。

表2 OPS冷凍對豬卵母細(xì)胞不同Caspase原位熒光染色后熒光強(qiáng)度的影響Table 2 Effect of OPS vitrification on porcine oocytes’fluorescence intensity after different-caspase in situ fluorescence staining

2.2 OPS玻璃化冷凍后對卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

本試驗利用相對熒光定量PCR檢測了凍后死亡受體外源性凋亡途徑中TNFα、FɑsL、CASP8和CASP3和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑中CASP9、CASP3、Bcl2、BAX、SOD1、P53和survivin等基因的mRNA表達(dá)狀況（圖2）。卵母細(xì)胞OPS冷凍后，TNFα和FɑsL的相對表達(dá)量分別為新鮮卵母細(xì)胞組的2.12和3.78倍，差異極顯著（P＜0.05），CASP8的基因表達(dá)量也有所升高（P＜0.05）。冷凍后CASP9、CASP3和P53的基因表達(dá)水平提高，Bcl2、BAX、SOD1和survivin的基因表達(dá)水平下降（P＜0.05），其中CASP9的表達(dá)水平提高5.39倍，而Bcl2和survivin的表達(dá)水平則僅為新鮮組的0.24和0.23倍。

圖2 冷凍對卵母細(xì)胞不同凋亡途徑中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effect of vitrification on expression of genes related in different apoptotic pathways

3 討論

死亡受體外源性凋亡途徑和線粒體內(nèi)源性凋亡途徑是哺乳動物細(xì)胞凋亡的兩個主要途徑。也被證實是卵母細(xì)胞和胚胎早期發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡的主要途徑［8］。死亡受體外源性凋亡途徑則是由死亡受體與相應(yīng)配體相結(jié)合而被激活，經(jīng)過級聯(lián)反應(yīng)，逐級激活起始胱天蛋白酶（如Caspase 8）和效應(yīng)胱天蛋白酶（Caspase 3，7等），從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡［9］。死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中研究最為詳細(xì)和最具代表的是受體Fas介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［10］。線粒體內(nèi)源性凋亡途徑通過凋亡誘導(dǎo)因子引起線粒體細(xì)胞色素C釋放，作為凋亡誘導(dǎo)因子，細(xì)胞色素C能與凋亡酶激活因子1、Caspase 9前體、ATP/dATP形成凋亡體，召集并激活Caspase 3，引發(fā)Caspases級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11-12］。

本試驗中，卵母細(xì)胞在玻璃化冷凍后TNFɑ和FɑsL的相對表達(dá)量都顯著升高，提示冷凍導(dǎo)致卵母細(xì)胞感應(yīng)外界凋亡信號敏感性增加。CASP8的基因表達(dá)和活性是啟動外源性凋亡途徑的重要因素［13-14］。本試驗中外源性凋亡途徑中的激發(fā)因子CASP8 mRNA豐度，Caspase 8活性均在冷凍后顯著提高，表明冷凍啟動了豬卵母細(xì)胞的外源性凋亡途徑，在細(xì)胞內(nèi)形成凋亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物DISC（Death-inducing signaling complex，DISC），啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)。

Dai等［15-16］研究表明，冷凍可造成卵母細(xì)胞線粒體形態(tài)、功能和分布的顯著損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平的顯著升高。Somfai等［17］研究表明冷凍能引起卵母細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放，使ROS水平顯著升高。Ren等［18］研究表明去脂后豬冷凍卵母細(xì)胞的線粒體功能提高，ROS水平降低證明冷凍導(dǎo)致卵母細(xì)胞氧化損傷。由于巰基乙醇可改變細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，Gupta等［19］在冷凍前進(jìn)行添加巰基乙醇結(jié)果提高了卵母細(xì)胞的抗凍能力。線粒體跨膜電位的消失、氧化損傷與細(xì)胞凋亡等相關(guān)［6］，凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosisinducing factor，AIF）及細(xì)胞色素C在凋亡中發(fā)揮重要的作用，細(xì)胞接到凋亡信號后，線粒體釋放出來的細(xì)胞色素C在ATP或dATP的協(xié)同作用下與凋亡蛋白酶活化因子I結(jié)合，使其分子結(jié)構(gòu)改變而激活Caspase9前體，并進(jìn)一步激活其下游Caspase 3等酶系列，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果表明，線粒體相關(guān)功能基因SOD1在冷凍后其mRNA表達(dá)量顯著下降，說明細(xì)胞的抗氧化能力顯著下降。Caspase 9是線粒體內(nèi)源性凋亡途徑中Caspase級聯(lián)反應(yīng)的激發(fā)者，本試驗中，CASP9在豬卵母細(xì)胞的mRNA表達(dá)量和活性均顯著升高，表明冷凍激發(fā)了其內(nèi)源性凋亡途徑。

Bcl2和survivin是線粒體凋亡途徑中的重要調(diào)控因子，其能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡狀態(tài)的重要標(biāo)識分子［21-22］。本研究中卵母細(xì)胞冷凍后這兩個凋亡相關(guān)因子表達(dá)量均有所下降，一方面表明凍后卵母細(xì)胞確實發(fā)生了細(xì)胞凋亡，另一方面也顯示其可能參與了線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑。

Caspase 3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行的效應(yīng)分子，參與凋亡過程中細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)固縮和凋亡體形成等多個過程［23］?，F(xiàn)今Caspase 3和總Caspase的原位熒光染色已經(jīng)被廣泛用于哺乳動物和胚胎凋亡狀況的檢測［23-25］。Ebrahimi在綿羊的GV期卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，凍后其Caspase 3的活性顯著升高，與其染色體損傷呈正相關(guān)，與本試驗中CASP3基因表達(dá)量的升高和原位熒光染色后的活性增加的研究結(jié)果相一致。在總Caspase的凋亡檢測方面，Gualtieri等在人卵母細(xì)胞的慢速冷凍中發(fā)現(xiàn)，凍后卵子的總Caspase水平顯著升高［25］。在豬上，Vallorani等［4］利用Cryotop法對豬MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍，結(jié)果凍后其FITCVAD-FMK染色后的總Caspase水平比冷凍前有顯著提高。本試驗中我們亦采用FITC-VAD-FMK對OPS冷凍的卵母細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果獲得了與上述研究相類似的結(jié)論，表明冷凍后卵母細(xì)胞的Caspase的活性發(fā)生了活化，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑共同介導(dǎo)了玻璃化冷凍后豬MII期卵母細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

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（責(zé)任編輯：程智強(qiáng)）

The apoptotic pathways of vitrified porcine oocytes at MII stage

WU Cai-feng，DAIJian-jun*，NIU Ying-fang，ZHANG Shu-shan，CHEN Ya-ning，ZAHNG De-fu*
（Division of Animɑl Genetic Engineering，Shɑnghɑi Key Lɑborɑtory of Agriculturɑl Geneticsɑnd Breeding；Animɑl Husbɑndryɑnd Veterinɑry Reseɑrch Institute，Shɑnghɑi Acɑdemy of Agriculturɑl Sciences，
Shɑnghɑi201106，Chinɑ）

In order to clarify the appopotic pathways of MII-stage porcine oocytes after vitrification，the Caspase 3，Caspase8，Caspase9 and Pan-caspase activities of vitrified porcine oocytes in death receptormediated and mitochondrion mediated apoptotic pathways were determined by in situ fluorescence staining，and themRNA expressions of key genes in different pathwayswere also detected by RT-PCR.The results were as follows：After vitrification of the MII-stage oocytes the fluorescence intensity values of Caspase 8，Caspase 9，Caspase 3 and Pan-caspase were respectively 32.03，16.56，16.70 and 8.43，and significantly higher than those of fresh oocytes’control groups（being 4.02，4.83，4.23 and 3.08 respectively）.After vitrification the expression levels of TNFα，F(xiàn)ɑsL，CASP8 and CASP3 genes had a certain increasing，those of CASP9，CASP3 and P53 genes presented an upward trend，whereas those of Bcl2，BAX，SOD1 and survivin genes significantly decreased.It was concluded that the apoptosis of MII-stage porcine oocytes after freezing was implicated in both death receptor mediated and mitochondrion mediated apoptotic pathways.

Pig；Oocyte；Vitrification；Apoptosis

S828

A

1000-3924（2017）01-138-06

2016-01-05

國家自然科學(xué)基金（31372315）；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX08006-005）；上海市農(nóng)業(yè)委員會青年人才計劃（2014-1-32，2014-1-33）

吳彩鳳（1983—），女，碩士，助理研究員，主要從事動物胚胎工程研究。E-mail：wucaifengwcf＠163.com

*通信作者，張德福E-mail：zhangdefuzdf＠163.com；戴建軍E-mail：blackman0520＠126.com