張清真，陶 潔，殷秀辰，熊年年，李 星，劉惠莉*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106；4上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201302）

豬流行性腹瀉病毒雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

張清真1，2，陶 潔1，3，4*，殷秀辰1，3，熊年年1，2，李 星1，2，劉惠莉1，3，4**

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106；4上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201302）

以乳化滅活的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）作為抗原，免疫大白兔，制備兔抗PEDV高免血清，純化抗PEDV IgG并進(jìn)行生物素標(biāo)記。以體外表達(dá)的PEDV S蛋白作為抗原，商品化的PEDV單克隆抗體作為捕獲抗體，生物素標(biāo)記的IgG作為檢測(cè)抗體，建立了檢測(cè)PEDV的生物素-親和素系統(tǒng)的雙抗夾心ELISA方法。結(jié)果表明：該方法最低檢測(cè)限量為20 ng/μL，且穩(wěn)定性和特異性較好。對(duì)25份臨床豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，3份檢出PEDV陽(yáng)性，與RT-PCR法的符合率為100%。本研究為PEDV臨床檢測(cè)提供了新方法，也為豬腹瀉病原的多重檢測(cè)技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。

豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)；重組S蛋白；雙抗體夾心ELISA

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）首次在英國(guó)報(bào)道［1］，是由冠狀病毒屬豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以食欲下降、腹瀉、嘔吐和脫水為特征的豬急性腸道傳染病［2］。2013年以來(lái)，我國(guó)大部分地區(qū)爆發(fā)仔豬腹瀉疫情，死亡率高達(dá)100%，2013年5月PED在美國(guó)首次爆發(fā)，造成300萬(wàn)頭仔豬死亡［3］；同年，古巴也報(bào)道了PED的流行［4］。王娜等［5］對(duì)2013—2014年遼寧省9個(gè)市228份腹瀉病料進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PEDV的陽(yáng)性率為37.72%，為豬腹瀉的主要病原，且流行范圍廣，季節(jié)性不明顯，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前臨床上對(duì)該病的診斷方法主要有RTPCR、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和ELISA等，病毒分離周期長(zhǎng)，且難度大；RT-PCR方法應(yīng)用較多，但難以滿足大量樣品普查的需求。目前，用于檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法被大量用于臨床實(shí)踐。時(shí)曉麗等［6］以純化細(xì)胞毒作為抗原，建立了檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法，可用于PEDV抗體檢測(cè)，但間接ELISA方法不利于早期發(fā)現(xiàn)病毒感染。李一經(jīng)等［7］用純化的病毒免疫小鼠制備單抗，建立了檢測(cè)豬排泄物中PEDV的雙抗夾心ELISA方法。本研究以體外重組表達(dá)S蛋白作為抗原，商品化單抗作為捕獲抗體，將生物素標(biāo)記IgG抗體作為二抗，建立檢測(cè)PEDV的生物素-親和素系統(tǒng)雙抗夾心ELISA方法，用于豬場(chǎng)大量樣品中PEDV的檢測(cè)和普查，以期為豬腹瀉多病原檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

豬流行性腹瀉細(xì)胞毒、重組表達(dá)的豬流行性腹瀉病毒S蛋白均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；SEPPIC ISA760佐劑由上海SEPPIC公司惠贈(zèng)；抗PEDV S蛋白特異性單克隆抗體（IgG2a亞型）購(gòu)自韓國(guó)MEDIAN公司；硫酸銨、脫脂乳、BSA為sigma產(chǎn)品；馬血清為Gibco公司產(chǎn)品；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、Protein G親和層新柱、Sulfo-NHSBiotin、HABA/Streptavidin購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；辣根過(guò)氧化物酶-鏈酶親和素（HRP-Streptavidin）為Biolegend產(chǎn)品；無(wú)蛋白封閉液、BSA、脫脂乳購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；TMB購(gòu)自北京必得公司。

1.2 兔抗PEDV高免血清的制備

用注射器將乳化好的SEPPIC760佐劑和PEDV細(xì)胞毒于背部皮下多點(diǎn)免疫兔子，7 d后二免。二免3 d后心臟采血，制備抗血清，分裝，－20℃保存。

1.3 兔抗PEDV IgG粗提

按常規(guī)方法［8］將分離的兔血清5 m L和等體積的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS：100 mmol/L磷酸二氫鈉，150 mmol/L氯化鈉；pH 7.2）混勻，0.45μm濾膜過(guò)濾后逐滴加入10 mL飽和硫酸銨溶液（pH 7.0）使其成50%飽和度，邊滴加邊攪拌，充分混合后4℃靜置過(guò)夜，4℃、6 000 r/min離心30 min，棄上清。沉淀用10 mL PBS溶解，再逐滴加入5 mL飽和硫酸銨溶液，使其成33%飽和度，邊滴加邊攪拌，同上離心，棄上清，重復(fù)3次后，所得沉淀為IgG抗體，用適量PBS液溶解，并用100倍體積的PBS 4℃透析48 h，期間更換PBS 4—5次。透析后的樣品于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 兔抗PEDV IgG純化

按照說(shuō)明書(shū)，利用Protein G親和層析柱純化兔抗PEDV粗提IgG抗體，SDS-PAGE電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純化后純度和濃度。采用Western Blot方法檢測(cè)純化后抗體反應(yīng)原性［9］。

1.5 抗PEDV IgG生物素標(biāo)記

按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抗體標(biāo)記。用脫鹽柱去除游離的生物素，生物素標(biāo)記后的抗體濃度用微量紫外分光光度計(jì)計(jì)算。HABA/Avidin試劑檢測(cè)標(biāo)記效率；用終質(zhì)量濃度為5μg/mL的PEDV S蛋白包被酶標(biāo)板，100μL/孔，間接ELISA評(píng)估標(biāo)記效果［10］。在標(biāo)記后的0 d、30 d、90 d和180 d分別檢測(cè)生物素標(biāo)記抗體活性即其穩(wěn)定性。

1.6 BAS-ELISA檢測(cè)體系的建立

用棋盤(pán)滴定法進(jìn)行條件優(yōu)化［11］。碳酸鹽緩沖液稀釋抗PEDV S蛋白單克隆抗體，包被96孔聚乙烯板，100μL/孔，終質(zhì)量濃度為0.15μg/mL、0.3μg/mL、0.6μg/mL。96孔板用薄膜密封，4℃孵育過(guò)夜。洗滌緩沖液（0.05%Tween20-PBS，pH 7.2）洗滌3次，拍干后，加入無(wú)蛋白封閉液封閉，每孔250μL，37℃孵育2 h；洗滌；每孔加入50μL樣品，設(shè)置PBS為對(duì)照孔，37℃孵育1 h；洗滌；分別加入2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL和16μg/mL生物素化抗體，37℃避光孵育1 h；洗滌；每孔分別加入1∶1 000、1∶2 000和1∶3 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶親和素50μL，37℃避光孵育1 h；洗滌；每孔加入TMB顯色液50μL，37℃避光孵育15 min；用2 mol/L H2SO450μL/孔終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀讀取A450 nm處的吸光值。若檢測(cè)樣品吸光值大于對(duì)照孔吸光值的2倍，則判定為陽(yáng)性。

1.7 最低檢出限量測(cè)定

將PEDV S蛋白進(jìn)行2倍倍比稀釋?zhuān)媒⒌腂AS-ELISA方法檢測(cè)蛋白最低檢出量。

1.8 臨床樣品檢測(cè)

采集上海、江蘇等地豬場(chǎng)疑似PEDV豬腹瀉病料25份，刮取腸內(nèi)容物，用建立的BAS-ELISA方法檢測(cè)。

1.9 RT-PCR檢測(cè)臨床樣品

根據(jù)參考文獻(xiàn)［12］，合成1對(duì)擴(kuò)增大小為654 bp的PEDV檢測(cè)引物，引物序列為PEDV-S-F：5’-CGGGTTACCAGCTTTATTTACATAAGG-3’；PEDV-S-R：5’-CGTCATTAATATTAAACCTCAGAGC-3’。利用RT-PCR方法對(duì)25份臨床樣品進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔抗PEDV IgG抗體的純化

用飽和硫酸銨沉淀法粗提兔抗PEDV IgG抗體，再用Protein G親和層析柱純化，測(cè)定純化IgG抗體質(zhì)量濃度為2 mg/mL。取5μg PEDV S蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后利用Western Blot檢測(cè)純化的IgG抗體（圖1）。在約110 kD處可見(jiàn)清晰的條帶，說(shuō)明純化的IgG抗體具有良好的特異性和反應(yīng)原性。

2.2 生物素標(biāo)記IgG抗體檢測(cè)

將5.9μL Sulfo-NHSBiotin溶液加入200μL 1 mg/mL脫鹽后的IgG抗體溶液，用HABA/Avidin檢測(cè)標(biāo)記效率。結(jié)果表明：1 mmol/L IgG抗體標(biāo)記了2.8 mmol/L生物素分子。用間接ELISA在標(biāo)記后的0 d、30 d、90 d和180 d分別檢測(cè)生物素化IgG，結(jié)果表明其穩(wěn)定性較好。

2.3 BAS-ELISA檢測(cè)體系條件優(yōu)化

經(jīng)棋盤(pán)法滴定及多次試驗(yàn)，獲得了BAS-ELISA方法的最佳條件（表1）。

圖1 W estern Blot檢測(cè)純化的抗PEDV IgG抗體Fig.1 Detection of purified anti PEDV IgG antibody by W estern Blot

表1 ELISA檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 Optim ization of reaction conditions for ELISA detection

2.4 最低檢出限量

用建立的BAS-ELISA方法檢測(cè)PEDV S蛋白的最低檢出限量為20 ng/μL。用建立的BAS-ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果一致，表明建立的方法重復(fù)性較好。

2.5 RT-PCR檢測(cè)臨床樣品

RT-PCR法檢測(cè)25份疑似PEDV豬腹瀉樣品，檢出3份陽(yáng)性樣品。擴(kuò)增這3個(gè)陽(yáng)性樣品的S基因，測(cè)序結(jié)果證實(shí)這3個(gè)分離毒株為PEDV。

2.6 雙抗夾心法檢測(cè)臨床樣品

用建立的BAS-ELISA方法檢測(cè)25份疑似豬腹瀉樣品，3份為PEDV陽(yáng)性，與RT-PCR檢測(cè)方法的符合率為100%。

3 討論

由于PEDV流行毒株細(xì)胞適應(yīng)性差，難以獲得高純度的病毒抗原，本研究選擇以重組表達(dá)S蛋白作為包被抗原來(lái)建立檢測(cè)方法。本研究利用商品化的抗PEDV單克隆抗體作為捕獲抗體，提高了雙抗夾心ELISA方法的特異性；用生物素化IgG作為二抗，由于多克隆抗體能夠識(shí)別多個(gè)抗原位點(diǎn)，也保證了該方法的高識(shí)別率。此外，生物素-親合素系統(tǒng)是一種生物級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)系統(tǒng)，其結(jié)合雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)一步提高了該方法的靈敏度，該方法對(duì)PEDV S蛋白最低檢測(cè)限量為20 ng/μL，特異性較好。

利用PEDV細(xì)胞毒免疫大白兔，制備抗血清，用飽和硫酸銨沉淀法粗提兔抗PEDV IgG，用Protein G親和層析柱純化，將純化前后樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，純化效果較好，對(duì)純化前后樣品濃度檢測(cè)，純化后得率高達(dá)75%，說(shuō)明該純化方法是在對(duì)多抗純度要求高的情況下的一種比較簡(jiǎn)便且高效的抗體純化方法。

用本研究建立的方法對(duì)25份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出3份陽(yáng)性樣品，與RT-PCR法的符合率為100%，證實(shí)了建立的雙抗夾心ELISA方法的有效性，說(shuō)明該方法可用于臨床樣品的檢測(cè)。但由于目前檢測(cè)樣品較少，部分指標(biāo)還需要加大樣品的檢測(cè)數(shù)量加以?xún)?yōu)化和完善。李一經(jīng)等［7］用建立的雙抗夾心ELISA方法和PCR方法檢測(cè)48份臨床樣品，陽(yáng)性樣品分別檢出19份和21份，陽(yáng)性符合率為90.5%，陰性符合率為100%。雷利等［13］用PEDV M蛋白親和層析純化法制備PEDV-IgY卵黃抗體和鼠抗PEDVIgY多克隆抗體建立該病毒的雙抗夾心ELISA法，用建立的ELISA方法和PCR方法對(duì)100份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，分別檢出6份和8份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性符合率為96%，陰性符合率為100%。

本研究建立的PEDV BAS-ELISA方法彌補(bǔ)了現(xiàn)有PEDV檢測(cè)方法的不足，為豬病毒性腹瀉多重病原檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Establishment of double antibody sandwich ELISA for detection of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）

ZHANG Qing-zhen1，2，TAO Jie1，3，4*，YIN Xiu-chen1，3，4，XIONG Nian-nian1，2，LIXing1，2，LIU Hui-li1，3，4**（1Institute of Animɑl Scienceɑnd Veterinɑry Medicine，Shɑnghɑi Acɑdemy of Agriculturɑl Sciences，Shɑnghɑi 201106，Chinɑ；2College of Fisheriesɑnd Life Science，Shɑnghɑi Oceɑn University，Shɑnghɑi201306，Chinɑ；3Shɑnghɑi Key Lɑborɑtory of Agriculturɑl Genetic Breeding，Shɑnghɑi201106，Chinɑ；4Shɑnghɑi Engineering Reseɑrch Center of Breeding Pig，Shɑnghɑi201302，Chinɑ）

The emulsified and inactivated porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）was used as antigen to prepare the rabbit anti PEDV hyperimmune serum，and the anti PEDV IgG was purified and labeled with biotin. A double sandwich ELISA method for the detection of biotin avidin system of PEDV was established，taking in vitro expression of PEDV S protein as antigen，commercial PEDV monoclonal antibody as capture antibody，biotin labeled IgG as detection antibody.The results showed that the detection limit of themethod was 20 ng/μL，and the stability and specificity were better.Twenty-five samples of swine diarrhea were detected，and positive PEDV was detected in 3 samples.The coincidence rate with RT-PCR was100%.This study provides a new method for the clinical detection of PEDV，and lays a foundation for the study ofmultiple detection techniques.

PEDV detection；Recombinant S protein；Double antibody sandwich ELISA

S852.65

A

1000-3924（2017）01-134-04

2015-04-27

滬農(nóng)科攻字（2013）第5-5號(hào)；滬農(nóng)科攻字（2013）第3-6號(hào)；滬農(nóng)科產(chǎn)字（2016）第6號(hào)；滬農(nóng)青字（2016）第1-35號(hào)

張清真（1989—），女，碩士，從事動(dòng)物病毒學(xué)研究

*共同第一作者

**通信作者，E-mail：huilil＠163.com