姚丹青，樓堅(jiān)鋒，朱文瑩，張微微，夏建明

（1上海市種子管理總站，上海 201103；2上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；3上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)校，上海 201699）

基于SNP標(biāo)記的黃瓜遺傳多樣性分析

姚丹青1，樓堅(jiān)鋒1，朱文瑩2，張微微3，夏建明1

（1上海市種子管理總站，上海 201103；2上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；3上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)校，上海 201699）

通過查詢NCBI、葫蘆科基因組網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)獲得42個(gè)黃瓜候選SNP位點(diǎn)。應(yīng)用高分辨率溶解曲線技術(shù)對(duì)71個(gè)市售黃瓜品種進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩選，并通過焦磷酸測(cè)序進(jìn)行SNP基因分型分析，探索SNP標(biāo)記在黃瓜品種鑒定中的應(yīng)用前景。結(jié)果表明：42個(gè)SNP位點(diǎn)中有30個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息量為0.027—0.528，平均為0.247；71個(gè)黃瓜品種兩兩間的遺傳相似系數(shù)分布在0.4032—0.9839，即30個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)信息可以將71份黃瓜品種區(qū)分開。

黃瓜；遺傳多樣性；SNP標(biāo)記；高分辨率溶解曲線；焦磷酸測(cè)序

黃瓜（Cucumis sɑtivus L.）是我國(guó)重要的蔬菜作物之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，1990—2011年文獻(xiàn)報(bào)道的黃瓜品種約238個(gè)，其中1990—2000年有125個(gè)品種（含常規(guī)種16個(gè)），2001—2011年有113個(gè)品種（均為雜交種）。對(duì)現(xiàn)有黃瓜品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，可以客觀、全面地了解當(dāng)前黃瓜育種的現(xiàn)狀和種質(zhì)基礎(chǔ)［1］。

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用大大促進(jìn)了植物遺傳學(xué)研究的發(fā)展。從早期的利用同工酶標(biāo)記、RAPD、RFLP、AFLP等技術(shù)，到現(xiàn)在常用的SRAP、SSR標(biāo)記，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已相繼開展了中國(guó)黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性及其親緣關(guān)系的研究［2-5］。在多種分子標(biāo)記技術(shù)中，單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（Single nucleotide polymorphisms，SNP）得到了越來越多研究者的關(guān)注。SNP標(biāo)記是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸替換或者較短片段的插入、缺失所引起的多態(tài)性［6］，它以其二態(tài)易于分型、遺傳穩(wěn)定性高、密度高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)分析等優(yōu)點(diǎn)成為繼擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、微衛(wèi)星（SSR）之后新一代的分子標(biāo)記［7］。目前，SNP標(biāo)記應(yīng)用在黃瓜遺傳多樣性上的研究甚少。

SNP能夠廣泛用于遺傳多樣性研究，這對(duì)于資源保護(hù)、種質(zhì)利用均有重要意義。Tanya等［8］對(duì)20對(duì)SSR引物和4對(duì)SNP引物的產(chǎn)物進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，兩種引物的PCR產(chǎn)物的多態(tài)性不相同，但發(fā)現(xiàn)二者的聚類分析結(jié)果是相近的，這說明SNP對(duì)物種的遺傳多樣性分析較適用。吳金鋒等［9］對(duì)480份甘藍(lán)型油菜進(jìn)行SNP與SSR遺傳多樣性分析，挑選出的3 900個(gè)SNP位點(diǎn)以及70個(gè)SSR位點(diǎn)可用于480份甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)分析和主成分分析，結(jié)果表明，該群體可分為3個(gè)生態(tài)類型。王俊等［10］對(duì)枇杷‘大五星’和‘龍泉1號(hào)’三倍體不同單株及其二倍體（46份）的候選基因進(jìn)行SNP分析，發(fā)現(xiàn)不同單株枇杷種質(zhì)之間存在較為豐富的遺傳多樣性，可利用篩選出的SNP標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析。王佳媛等［11］以野生凹葉木蘭為材料，利用SNP標(biāo)記進(jìn)行了29份凹葉木蘭的遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，采自兩個(gè)不同居群的凹葉木蘭具有較高的遺傳多樣性，為后續(xù)其保護(hù)政策的制定提供了參考。

本研究通過查詢NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、葫蘆科基因組網(wǎng)站（CuGenDB，http：//www. icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi）數(shù)據(jù)庫(kù)，在7對(duì)染色體上平均選取42個(gè)黃瓜候選SNP位點(diǎn)，對(duì)71個(gè)市售黃瓜品種進(jìn)行SNP基因分型分析，旨在通過篩選出的SNP標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用市售的71份黃瓜雜交品種作為試驗(yàn)材料，其詳細(xì)特征見表1。

表1 市售黃瓜品種來源及特征特性Table 1 Source and characteristics of commercial available cucumber varieties

1.2 DNA提取

71個(gè)市售黃瓜品種每個(gè)品種取子葉，液氮冷凍研磨，加入CTAB裂解緩沖液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，20 mmol/L Na2EDTA）750μL，65℃恒溫水浴裂解1 h，后續(xù)DNA提取純化按樹脂型基因組DNA提純?cè)噭┖胁僮鬟M(jìn)行。提取的DNA取2μL樣品于Nanodrop 2000 C微量分光光度計(jì)上進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測(cè)。DNA提取后濃度統(tǒng)一稀釋至90 ng/μL。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

通過查詢NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、葫蘆科基因組網(wǎng)站（CuGenDB，http：//www.icugi.org/ cgi-bin/ICuGI/index.cgi）數(shù)據(jù)庫(kù)選取42個(gè)候選SNP位點(diǎn)，平均分布在黃瓜7對(duì)染色體上。高分辨率溶解曲線檢測(cè)（HRM）和焦磷酸測(cè)序引物使用軟件PyroMark Assay Design 2.0設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程有限公司合成，上下游引物純化級(jí)別為HAP，測(cè)序引物純化級(jí)別為ULTRAPAGE。

1.4 高分辨率溶解曲線（HRM）檢測(cè)

HRM檢測(cè)在Qiagen real-time PCR system上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增采用20μL反應(yīng)體系，其中10×Taq buffer 2μL，25 mmol/L Mg2＋2.2μL，10 mmol/L dNTP mix 0.6μL，上下游引物（10μmol/L）各0.2μL，DNA模板（90 ng/μL）2μL，5 U/μL Taq Ploymerase 0.4μL，20×Evagreen（Biotium Corporation）1μL，雙蒸水補(bǔ)足20μL。

反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃20 s（35個(gè)循環(huán)）；降溫至65℃，并逐步上升至85℃。

1.5 SNP位點(diǎn)的分型驗(yàn)證

針對(duì)HRM篩選得到的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物（PyroMark Assay Design 2.0軟件），包括PCR正向引物PCR-F、反向引物PCR-R和測(cè)序引物Sequencing primer，用于制備測(cè)序反應(yīng)模板的PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。其中Biotin-為生物素標(biāo)記修飾。引物由上海生工生物工程有限公司合成，普通引物純化級(jí)別為HAP級(jí)，生物素標(biāo)記引物純化級(jí)別為HPLC級(jí)，測(cè)序引物純化級(jí)別為ULTRAPAGE級(jí)。

PCR擴(kuò)增采用50μL反應(yīng)體系，其中10×Taq buffer 5μL，25 mmol/LMg2＋5μL，10 mmol/L dNTPmix 1μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板（90 ng/μL）2μL，5 U/μLTaq Ploymerase1μL，雙蒸水補(bǔ)足50μL。

反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃40 s（50個(gè)循環(huán)）；72℃延伸5 min，4℃保存。

焦磷酸測(cè)序反應(yīng)在PyroMark ID焦磷酸測(cè)序儀（Qiagen）上進(jìn)行。配置Binding buffer（40μL）和Sepharoe beads（2μL）的Mix 80μL體系，加入30μL PCR產(chǎn)物，1 300 r/min渦旋混勻15 min，使得beads與生物素結(jié)合；經(jīng)Vacuum prep workstation單鏈分離，釋放到預(yù)先加入38μL Annealing buffer和2μL測(cè)序引物（10μmol/L）的PSQ 96測(cè)序反應(yīng)板中，80℃金屬加熱塊（Labnet）上加熱2—5 min后冷卻至室溫。將酶、底物和A、T、C、G成分加入試劑倉(cāng)，即可上機(jī)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果可通過分型分析模式（Genotyping）直接獲得樣品SNP類型。

1.6 數(shù)據(jù)分析

對(duì)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多態(tài)信息量PIC值使用PIC＿CALC軟件進(jìn)行計(jì)算。利用NTSYS-pc（Version 2.10）軟件中的SIMQUAL程序計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并獲得相似系數(shù)矩陣，再用其中的SAHN程序和UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，最后通過Tree plot程序生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 42個(gè)候選位點(diǎn)HRM掃描分析

分別用42對(duì)引物對(duì)71個(gè)黃瓜品種材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增及HRM掃描分析。通過標(biāo)準(zhǔn)視圖（圖1a和圖2a）和差異視圖（圖1b和圖2b）顯示，71個(gè)黃瓜品種中含有候選SNP位點(diǎn)的3種變異類型。通過HRM共篩選出30對(duì)多態(tài)性較好的SNP引物（表2）。

圖1 Chr0106位點(diǎn)（左）、Chr0205位點(diǎn)（中）、Chr0303位點(diǎn)（右）HRM分析結(jié)果Fig.1 HRM analysis results of Chr0106，Chr0205，Chr0303 SNP sites

圖2 Chr0505位點(diǎn)（左）、Chr0602位點(diǎn)（中）、Chr0703位點(diǎn)（右）HRM分析結(jié)果Fig.2 HRM analysis results of Chr0505，Chr0602，Chr0703 SNP sites

表2 篩選出的30對(duì)引物的SNP位點(diǎn)類型及焦磷酸測(cè)序引物序列Table 2 The genotype，pyrosequencing primers of 30 SNP sites screened out by 30 pairs of primers

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

2.2 30個(gè)SNP位點(diǎn)的分型確定

根據(jù)HRM掃描結(jié)果，對(duì)上述30個(gè)候選SNP位點(diǎn)的不同堿基變異類型進(jìn)行PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序，確認(rèn)SNP分型類型。測(cè)序結(jié)果顯示，不同SNP分型的堿基序列不同，與預(yù)期序列相符（圖3，圖4），且結(jié)果與HRM篩選結(jié)果中變異類型分組相一致。

圖3 Chr0106位點(diǎn)（左）、Chr0205位點(diǎn)（中）、Chr0303位點(diǎn)（右）焦磷酸測(cè)序驗(yàn)證Fig.3 The results of pyroseqencing for Chr0106，Chr0205，Chr0303 SNP sites

2.3 30個(gè)SNP位點(diǎn)的PIC值分析

根據(jù)30個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分型結(jié)果，分析30個(gè)位點(diǎn)在71個(gè)市售黃瓜品種材料中的等位基因頻率、基因型頻率和多態(tài)信息量，結(jié)果顯示（表3）：30個(gè)SNP位點(diǎn)的PIC值在0.027—0.528，Chr0303位點(diǎn)的PIC值高達(dá)0.528，處于高度多態(tài)；Chr0105、Chr0106、Chr0108、Chr0203、Chr0205、Chr0206、Chr0501、Chr0505、Chr0506、Chr0602、Chr0703位點(diǎn)的PIC值處于中度多態(tài)。

圖4 Chr0505位點(diǎn)（左）、Chr0602位點(diǎn)（中）、Chr0703位點(diǎn)（右）焦磷酸測(cè)序驗(yàn)證Fig.4 The results of pyroseqencing for Chr0505，Chr0602，Chr0703 SNP sites

表3 SNP位點(diǎn)頻率、多態(tài)信息量分析結(jié)果Table 3 Analysis of allele frequency，genotype frequency and polymorphism information content

（續(xù)表3）

2.4 遺傳多樣性分析

圖5 71份市售黃瓜品種UPGM A聚類圖Fig.5 The UPGMA clustering m ap of 71 cucum ber varieties

根據(jù)NTSYS軟件的SIMQUAL程序計(jì)算的結(jié)果可知，71個(gè)黃瓜品種兩兩間的遺傳相似系數(shù)分布在0.4032—0.9839。聚類分析結(jié)果（圖5）顯示，以0.55為閾值可以把71個(gè)黃瓜材料分為2個(gè)類群。第Ⅰ類群共65個(gè)品種，主要包括華北密刺型、旱黃瓜、華南型、日韓型這三大類型黃瓜。在0.82處，又可分為7個(gè)亞族（A、B、C、D、E、F、G）。A亞族主要包括華北密刺型、旱黃瓜和部分華南型黃瓜；在0.86處再進(jìn)行細(xì)分，可將A亞族再分為6小類（a、b、c、d、e、f）。a類可分成3個(gè)小組（a1、a2、a3），a1包括30份黃瓜材料，主要為華北密刺型（棍棒狀，果皮深綠色，瘤密，多白刺）和旱黃瓜類型（果實(shí)較短，果皮白綠色或淺綠，果瘤稀少，刺少），其中C50（果皮深綠，黑刺瘤稀疏）、C52和C58（亮綠色小型黃瓜，少刺光滑型）不同于其他材料。a2均為華南型和日韓型，果皮淺綠色，瘤稀少刺型；a3中的C64和C65均為加工型黃瓜，果皮墨綠色，產(chǎn)地均為廣東；b類中C23為白皮黃瓜，其余2份材料C27和C30均為華北密刺型；c類僅有C71 1份材料，水果型黃瓜，光滑暗綠色；e類包括C7、C14、C18，均為旱黃瓜，果皮嫩綠偏白色，白刺；f類也僅包括C6一份材料，棒狀，刺瘤少，果皮淺綠色。B亞族包括5份材料，均屬于華南型黃瓜，少刺光滑型，果皮亮綠色。C亞族包括旱黃瓜（‘極早熟旱黃瓜291’‘龍園綠春’）和華南型黃瓜（‘寶雜2號(hào)’‘南雜2號(hào)’，產(chǎn)地均為上海）。D亞族包括2份材料，均為華南型黃瓜，產(chǎn)地均為山東，果皮綠色光滑，外形略相似。E亞族包括一份旱黃瓜材料C4和一份白皮黃瓜C24，以及一份華北密刺型黃瓜C31。F亞族為C22‘改良白絲條’，果皮白綠相間花紋。G亞族為水果型黃瓜C68‘小泉一郎’。第Ⅱ類群共6個(gè)品種，主要包括2個(gè)華南型材料（‘申青一號(hào)’‘萃斯五號(hào)’）和4個(gè)水果型黃瓜（‘中農(nóng)19號(hào)’‘萃斯二號(hào)’‘碧玉二號(hào)’‘玉光迷你’）。

3 討論

以往研究大都是利用黃瓜基因組SSR標(biāo)記對(duì)黃瓜品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，而本研究是利用黃瓜SNP標(biāo)記對(duì)71個(gè)市場(chǎng)上銷售的黃瓜品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。本研究所用的SNP標(biāo)記都是在現(xiàn)有的遺傳圖譜基礎(chǔ)上，挑選均勻分布在7條染色體上的引物，并通過HRM篩選多態(tài)性較好的位點(diǎn)再進(jìn)行SNP分型。因此，能夠檢測(cè)出不同品種的遺傳多樣性，可以更客觀地反應(yīng)不同生態(tài)型品種的信息差異。

從試驗(yàn)材料類型上看，本研究涵蓋旱黃瓜、華北密刺型黃瓜、華南型黃瓜、日韓型黃瓜、白皮黃瓜、加工型黃瓜、歐洲型水果黃瓜等多種類型。研究結(jié)果表明，華北型和歐洲型的黃瓜分布相對(duì)集中，其他類型的分布比較寬廣。前人研究表明，日本少刺型黃瓜與我國(guó)華南型黃瓜的親緣關(guān)系較近，華南型黃瓜的遺傳多樣性較為豐富，在果皮顏色上有很大的差異，而我國(guó)特有的華北密刺型黃瓜則與其他類型黃瓜的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)［1］。從本研究聚類分析結(jié)果看，華北密刺型黃瓜主要集中在a1小組，只有少數(shù)旱黃瓜品種被聚類其中。a2小組中日韓型黃瓜與我國(guó)華南型黃瓜聚在一組，與前人研究結(jié)果一致，同樣表明二者親緣關(guān)系較近。另外，第Ⅱ類群中華南類型和水果型黃瓜被劃在同一類群中，說明水果型和華南類型雖然在形態(tài)學(xué)存在一定的差異，但它們也有可能存在較近的親緣關(guān)系。第Ⅱ類群中的‘申青一號(hào)’，其母本為歐洲型水果黃瓜‘戴多星’經(jīng)連續(xù)6代自交選育出的全雌性自交系DS-2-1-2-1，父本為‘寶雜2號(hào)’5代自交選育出的B-2-2-1，因此‘申青一號(hào)’具有歐洲型黃瓜遺傳背景，所以與水果型黃瓜的遺傳距離較近，聚成一類。

黃瓜種質(zhì)資源遺傳差異較小，多樣性水平較低，一方面利用現(xiàn)有資源，通過人工雜交，實(shí)現(xiàn)基因間相互參透，能夠?yàn)橥貙掽S瓜育種的遺傳背景奠定基礎(chǔ)；另一方面，從起源地大量引進(jìn)資源對(duì)豐富我國(guó)黃瓜遺傳背景和品種改良至關(guān)重要。目前，市場(chǎng)上同種多名現(xiàn)象較為突出，導(dǎo)致品種真實(shí)性問題較為嚴(yán)重，利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)種子真實(shí)性和純度進(jìn)行鑒定是目前最為有效的方法之一。

［1］苗晗，張圣平，顧興芳，等.中國(guó)黃瓜主栽品種SSR遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2014，15（2）：333-341.

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Genetic diversity analysis of cucumber based on SNPmarkers

YAO Dan-qing1，LOU Jian-feng1，ZHUWen-ying2，ZHANGWei-wei3，XIA Jian-ming1
（1Shɑnghɑi Seed Mɑnɑgement Stɑtion，Shɑnghɑi201103，Chinɑ；2School of Agriculture＆Biology，Shɑnghɑi Jiɑo Tong University，Shɑnghɑi200240，Chinɑ；3Shɑnghɑi Vocɑtionɑl College of Agricultureɑnd Forestry，Shɑnghɑi201699，Chinɑ）

Forty-two cucumber candidate single nucleotide polymorphism（SNP）loci were obtained by searching NCBI and genome database of gourd family.The SNP loci of 71 commercially available cucumber varieties were screened by high resolution melting（HRM），and the SNP genotyping was analyzed by pyrosequencing to explore the application prospect of SNPmarkers in cucumber cultivar identification.Results showed that the polymorphism information content（PIC）of 30 lociwere 0.027—0.528 in the 42 SNP loci，with an average of 0.247.The genetic similarity coefficient between any two samples was in 0.4032—0.9839. Namely，the genotyping data information of 30 SNP loci could separate the 71 cucumber varieties.

Cucumber；Genetic diversity；Single nucleotide polymorphism（SNP）；High resolution melting（HRM）；Pyrosequencing technology

S642.2

A

1000-3924（2017）01-021-10

2015-09-10

“十二五”國(guó)家863現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域項(xiàng)目（2012AA100101）；上海市科委重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（12391901500）；上海市科技興農(nóng)項(xiàng)目［滬農(nóng)科攻字（2012）第2-1號(hào)］

姚丹青（1984—），女，碩士，農(nóng)藝師，研究方向：分子植物育種和種子質(zhì)量檢驗(yàn)。E-mail：ydq＿726＠163.com