楊 娟 ， 吳海濱 ， 黃 超 ， 譚 珊 ， 吳培福

(西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明650224)

昆明市區(qū)雞源大腸桿菌毒力基因的流行特征試驗

楊 娟 ， 吳海濱 ， 黃 超 ， 譚 珊 ， 吳培福

(西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明650224)

大腸桿菌致病性及其攜帶毒力基因的種類存在相關(guān)性，為此，研究大腸桿菌毒力基因的流行特征對生產(chǎn)實踐和食品安全具有指導(dǎo)意義。本研究從昆明市農(nóng)貿(mào)市場隨機采集雞肝，從中分離鑒定大腸桿菌，并對12種毒力基因的流行特征進了研究。結(jié)果表明：從雞肝中共分離鑒定出140株大腸桿菌；feoB毒力基因攜帶率為100%；fimA和traT毒力基因攜帶率均為99.29%；papC毒力基因檢出率最低為21.43%。91.67%毒力基因檢出率在50%以上，33.33%毒力基因在90%以上，同時攜帶12種毒力基因的概率為3.57%。提示：昆明市各區(qū)農(nóng)貿(mào)市場雞肝中大腸桿菌毒力基因攜帶率高。

禽源大腸桿菌 ； 毒力基因 ； 流行特征

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸埃希菌引起的一種傳染性疾病。禽大腸桿菌的致病性由APEC的多種毒力基因共同決定。當細菌侵入機體并發(fā)病時，這些毒力因子相互協(xié)調(diào)、共同作用。到目前為止，已知的毒力因子有：溫度敏感血凝素、粘附素、鐵離子獲得系統(tǒng)(耶爾森菌強毒力島、氣桿菌素)、Iss蛋白、腸細胞脫落位點毒力島、毒素、ColV和ColBM質(zhì)粒等[1]。與毒力因子相關(guān)的毒力基因決定了大腸桿菌的致病性[2]。本試驗對140株禽源性大腸桿菌分離菌進行irp2、fimA、papC、iss、tsh、fyuA、feoB、iroN、iucC、iutA、cvaC、traT 12種毒力基因的PCR檢測，目的在于了解禽源大腸桿菌分離株中毒力基因的攜帶情況，進一步探明毒力基因與菌株致病性的相關(guān)性，為禽源性大腸桿菌致病機理的研究及制定有效的防制措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雞肝(2015年5月分別隨機采集于昆明市呈貢區(qū)、官渡區(qū)、盤龍區(qū)、西山區(qū)、五華區(qū)的農(nóng)貿(mào)市場，每區(qū)3個農(nóng)貿(mào)市場，每個農(nóng)貿(mào)市場至少采集8個雞肝，共310個)；LB固體培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基，均購自昆明碩陽科技有限公司。

1.2 大腸桿菌分離與鑒定 本試驗對雞肝中其他種的細菌也進行了分離，故先采用LB固體培養(yǎng)基分離細菌，而后利用麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基來初步篩選大腸桿菌，最后利用PCR技術(shù)和生化試驗進一步鑒定大腸桿菌。PCR鑒定(Uid和16S rRNA基因)所用引物參見文獻[3-4]。生化試驗包括：糖發(fā)酵試驗(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖)、明膠液化試驗、硫化氫試驗、吲哚(靛基質(zhì))試驗、甲基紅(M.R.)試驗、V-P試驗、枸櫞酸鹽利用試驗。

1.3 毒力基因的擴增 通過全菌裂解法提取大腸桿菌基因組DNA，并對12種毒力基因的流行情況進行了檢測。12種毒力基因包括：feoB、traT、fimA、fyuA、irp2、roN、iucC、tsh、iutA、iss、cvaC和papC。擴增引物及參數(shù)參考文獻[7]，由鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定 總共分離到504株細菌，最終鑒定出140株大腸桿菌，檢出率為27.78%。分離的大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長為表面光滑、邊緣整齊、圓形隆起的紅色菌落；在伊紅美藍培養(yǎng)基上為黑色帶金屬光澤的菌落；革蘭染色均為陰性，生化鑒定特征符合大腸桿菌的特性(見表1)。大腸桿菌兩種基因的PCR鑒定均為陽性，條帶大小與預(yù)計大小一致。

表1 140株大腸桿菌生化鑒定結(jié)果

⊕：產(chǎn)酸產(chǎn)氣；+：陽性；-：陰性

2.2 昆明市農(nóng)貿(mào)市場大腸桿菌毒力基因分布 本研究對140株大腸桿菌12個毒力基因進行檢測，結(jié)果見表2。編碼介導(dǎo)鐵攝取的feoB的檢出率最高，為100%；編碼與血清抵抗相關(guān)的外膜蛋白的traT基因和與I型菌毛相關(guān)的fimA基因檢出率次之，為99.29%；編碼P菌毛的papC基因檢出率最低為21.43%。91.67%的毒力基因檢出率在50%以上。

昆明市農(nóng)貿(mào)市場各區(qū)大腸桿菌feoB毒力基因全部檢出。cvaC、irp2基因西山區(qū)檢出率低于其他區(qū)，而iroN和iutA基因西山區(qū)的檢出率高于其他區(qū)，iss毒力基因在五華區(qū)和西山區(qū)的檢出率相差不大，均低于其他區(qū)。papC、tsh基因分別在五華區(qū)、盤龍區(qū)檢出率最低。各區(qū)的feoB、fimA、fyuA、iroN、irp2、iucC、iutA、traT基因檢出均在50%以上。每個區(qū)的papC毒力基因檢出率在50%以下。

表2 大腸桿菌相關(guān)毒力基因的分布

注：A：呈貢區(qū)；B：官渡區(qū)；C：盤龍區(qū)；D：五華區(qū)；E：西山區(qū)

2.3 毒力基因數(shù)量分布情況 見表3。

表3 毒力基因數(shù)量分布情況

本試驗中每株大腸桿菌同時攜帶不少于5個毒力基因，大于20株同時攜帶8～11個毒力基因。5株(3.57%)同時攜帶12個毒力基因(見表3)。

同時攜帶HPI強毒力島的標志基因fyuA和irp2兩個基因的檢出率為81.43%。31.43%的菌株同時攜帶不少于4個毒力基因(iss、irp2、papC、tsh、cvaC)。134株至少含有2個以下iutA、iss、tsh、iroN、irp2、cvaC 6種毒力基因。

3 討論

大腸桿菌病屬人獸共患病，發(fā)病機制不僅與血清型有關(guān)還與所攜帶的毒力基因有關(guān)[3]。根據(jù)以往研究對APEC、EPEC、EHEC、ETEC、UPEC及非致病性大腸桿菌的毒力基因比較分析，證明APEC至少含有以下4個毒力基因：astA、iss、irp2、papC、iucD、tsh、vat、cva/cvi，而禽非致病性大腸桿菌的含量少于3個毒力基因[5]。由此可見，對禽致病性大腸桿菌毒力基因的種類和攜帶率進行檢測具有重要的實踐指導(dǎo)意義。

董向磊[6]對APEC的feoB、traT、iroN、iucC毒力基因的檢出率分別為：97.6%、87.43%、76.64%、74.85%。王利勤[7]對APEC的tsh、iutA、iss、papC毒力基因檢出率分別為：61.8%、70.3%、55.6%、20%。李葉芳等對APEC的irp2和fyuA檢出率都為100%[8]。本試驗檢測了禽源性大腸桿菌毒力基因的攜帶率，得出了feoB(100%)、traT(99.29%)、iroN(75.29%)、tsh(65%)、papC(21.43%)、iss(58.57%)、iucC(73.57%)、iutA((62.14%)、irp2(87.14%)、fyuA(92.86%)，與上述研究基本一致。

金文杰等研究發(fā)現(xiàn)，禽源致病性大腸桿菌中fyuA+irp2基因的檢測率為44.9%[9]。Ons等研究發(fā)現(xiàn)，雞源致病性大腸桿菌fyuA毒力基因檢出率為53.1%[10]。王利勤研究發(fā)現(xiàn)，雞源致病性大腸桿菌分離株的irp2、fyuA基因的檢出率分別為66.6%、77.8%，fyuA+irp2基因的檢出率為60.9%[7]。本試驗對fyuA、irp2毒力基因的檢出率分別為92.86%、87.14%，fyuA+irp2基因的檢出率為81.43%。均比上述試驗結(jié)果偏高。這說明昆明市農(nóng)貿(mào)市場禽源性大腸桿菌中HPI的攜帶率高，與菌株的致病性密切相關(guān)。

本試驗對昆明市農(nóng)貿(mào)市場各區(qū)大腸桿菌毒力基因進行了檢測，除feoB、fimA、traT基因外，其他基因在每個區(qū)存在很大差異，這間接反映了昆明市各農(nóng)貿(mào)市場雞來源可能不同，同時反映出昆明市周邊地區(qū)雞場致病性大腸桿菌的攜帶率亦可能不同。

綜上所述，昆明市各農(nóng)貿(mào)市場雞肝大腸桿菌的毒力基因之間存在差異，并且大腸桿菌的致病性與毒力基因攜帶的種類和攜帶率有關(guān)，大腸桿菌攜帶毒力基因的種類越多、攜帶率越高致病性越強。本試驗對禽源性大腸桿菌的流行病學調(diào)查和毒力基因的攜帶率提供了一定的理論依據(jù)。

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2016-01-20

云南省優(yōu)勢特色重點學科生物學建設(shè)項目(50097505)；云南省高校林下生物資源保護及利用科技創(chuàng)新團隊(51400605)

楊娟(1992-)，女，碩士生，研究方向為動物疫源疫病，E-mail：m18788189620@163.com

吳培福，E-mail：jed-wu2008@126.com

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