趙雨川 ， 吳永繼 ， 劉增援 ， 孫燕杰 ， 胡 梅 ， 司紅彬

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 廣西南寧530005)

烏蕨醇提物聯(lián)合抗生素對CTX-M型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的作用研究

趙雨川 ， 吳永繼 ， 劉增援 ， 孫燕杰 ， 胡 梅 ， 司紅彬

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 廣西南寧530005)

為了探討烏蕨醇提物的藥效以及與抗生素聯(lián)用對CTX-M型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的體外抑菌效果，為烏蕨的綜合開發(fā)利用和防治此類耐藥大腸桿菌感染提供一定的參考依據(jù)。用70%乙醇冷浸烏蕨粉末兩次，每次7 d，過濾蒸干后用濃度為4%二甲基亞砜(DMSO)溶解，最終藥物濃度為0.064 g/mL。先用二倍微量稀釋法測定烏蕨醇提物和15種抗生素對2株受試菌的最小抑菌濃度(MIC)，再用微量棋盤稀釋法進行聯(lián)合藥敏試驗，測定烏蕨醇提物與抗生素聯(lián)用的分級抑菌濃度指數(shù)(FICI)。結(jié)果：(1)號菌株：烏蕨醇提物與磷霉素的FICI為0.281，表現(xiàn)為協(xié)同作用；與頭孢曲松鈉、頭孢他啶、頭孢噻肟鈉、頭孢噻呋鈉、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、林可霉素、氟苯尼考、利福平的FICI分別為0.563、0.516、0.516、0.563、0.75、0.625、0.625、0.625、0.75，均表現(xiàn)為相加作用；與氟喹諾酮類藥物的FICI范圍為9～65，均表現(xiàn)為拮抗作用；(2)號菌株：烏蕨醇提物與磷霉素、磺胺間甲氧嘧啶、林可霉素的FICI分別為0.281、0.375、0.5，均表現(xiàn)為協(xié)同作用；與頭孢曲松鈉、頭孢他啶、頭孢噻肟鈉、頭孢噻呋鈉、阿莫西林、氟苯尼考、利福平的FICI分別為0.504、0.516、0.504、0.502、0.504、0.625、0.75，均表現(xiàn)為相加作用；與氟喹諾酮類藥物的FICI范圍為4.5～32.5，均表現(xiàn)為拮抗作用。

烏蕨； 醇提物； CTX-M； 聯(lián)合作用

在規(guī)模化養(yǎng)殖領(lǐng)域，抗生素一直是治療致病性大腸桿菌感染的首選，但隨著抗生素的濫用，很多種耐藥大腸桿菌已經(jīng)廣泛流行，CTX-M型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌便是其中最為常見的一類[1]，對此類耐藥菌引起的疾病采用抗生素治療已收效甚微，因此急需開發(fā)出一種高效、無毒的藥物對CTX-M型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌進行防治[2]。烏蕨(StenolmachusanumChing)為鱗始蕨科(又稱陵始蕨科)烏蕨屬植物，又名大葉金花草、小葉野雞尾、蜢蚱參、細葉鳳凰尾等，是一種傳統(tǒng)民間中藥，其味微苦，性寒，具有清熱解毒，利濕，止血的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，烏蕨具有抗菌[3]、抗氧化[4]等功效，擁有良好的開發(fā)前景。目前關(guān)于烏蕨抑制CTX-M型大腸桿菌耐藥性方面的研究尚處于空白，本試驗采用醇提法提取烏蕨，通過二倍微量稀釋法和微量棋盤稀釋法進行體外抑菌試驗。醇提物中的某些成分不溶于水，需加入一定量的二甲基亞砜(DMSO)助溶，為了排除DMSO對體外抑菌試驗的干擾[5]，本試驗通過繪制不同濃度DMSO環(huán)境下大腸桿菌的生長曲線，探索其不影響細菌正常生長的濃度范圍。

1 材料與方法

1.1 材料 烏蕨，購自廣西太華藥業(yè)有限公司；2株CTX-M型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌由本人從病料中分離鑒定；普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、腸桿菌科生化鑒定管、LB肉湯，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；二甲基亞砜，購自西隴化工股份有限公司；抗生素均購自廣西萬豐藥業(yè)有限公司，皆在有效期內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與鑒定 采集病死仔豬腸道內(nèi)容物，接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，依次進行菌株分離純化、革蘭染色鏡檢、生化鑒定、ESBLs確證[6]、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、紫外熒光顯色以及基因測序。

1.2.2 檢測DMSO對大腸桿菌的影響 首先采用肉湯二倍微量稀釋法，測定DMSO的MIC；然后在低于MIC的范圍內(nèi)，設(shè)置不同的DMSO濃度組，分別添加到菌液中，每組分裝成16支試管，置于37 ℃、220 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)，每間隔1 h用分光光度計測定每組菌液的吸光度，繪制生長曲線[7]。

1.2.3 烏蕨醇提物的制備 稱取100 g烏蕨全草進行粉碎，置1 000 mL燒杯中，加入10倍體積的70%乙醇，搖勻后封口冷浸兩次，每次7 d。將浸出物過濾后徹底蒸干，得到紅褐色半固體。用分析天平稱量6.4 g，加入純DMSO 4 mL，然后用滅菌蒸餾水定容至100 mL，最終藥物濃度為0.064 g/mL。過濾滅菌后冷藏備用。

1.2.4 藥敏試驗 采用肉湯二倍微量稀釋法分別測定烏蕨醇提物以及15種抗菌藥對大腸桿菌的MIC。

1.2.5 中西藥聯(lián)合棋盤試驗 采用聯(lián)合棋盤法，測定烏蕨醇提物與15種抗生素聯(lián)合作用的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離鑒定結(jié)果 最終分離鑒定得到2株CTX-M型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌：①號菌株含CTX-M基因，片段大小為908 bp；②號菌株同時含有CTX-M基因和fosA3基因，片段大小分別為881 bp和257 bp。

2.2 DMSO對大腸桿菌的影響 結(jié)果表明，只要DMSO的濃度低于5%，便可確保有機溶劑不影響大腸桿菌正常生長。本試驗所配制的烏蕨醇提物藥液中的DMSO濃度只有4%，所以不會干擾體外抑菌試驗。

2.3 中西聯(lián)合藥敏試驗的結(jié)果 烏蕨醇提物單獨使用具有一定的抑菌效果，MIC為0.032 g/mL；聯(lián)合用藥過程中可使磷霉素、β-內(nèi)酰胺類藥物、磺胺間甲氧嘧啶、林可霉素、氟苯尼考、利福平等抗生素的MIC不同程度的降低，與氟喹諾酮類藥物均表現(xiàn)為拮抗作用。具體的MIC值和FICI值見表1和表2。

3 討論

CTX-M是由質(zhì)粒介導(dǎo)的基因，許多研究已經(jīng)證明，位于質(zhì)粒上的基因可在同種甚至不同種的細菌之間進行傳播[8]，這種特性進一步增加了其危害性以及防治的困難。雖然早期的菌株對頭孢他啶敏感，但在抗生素持續(xù)濫用的大環(huán)境下，已經(jīng)出現(xiàn)了可以水解頭孢他啶的新CTX-M型[9]，因此，僅僅依靠對新抗生素的開發(fā)已經(jīng)不足以應(yīng)對層出不窮的新型耐藥菌株。

任冰如[10]分離鑒定了烏蕨乙醇提取物中的牡荊素、山奈酚、葒草苷、芹菜素、丁香酸、龍膽酸、香草酸、原兒茶醛、胡蘿卜苷等19種化合物，本試驗證明了烏蕨醇提物對CTX-M型產(chǎn)ESBLs大腸桿菌具有抑菌作用，具體是哪一種成分發(fā)揮作用還有待進一步的研究；聯(lián)合棋盤試驗中，烏蕨醇提物與β-內(nèi)酰胺類藥物都表現(xiàn)出不同程度的相加作用，是否因為烏蕨醇提物本身的抑菌作用使細菌增殖受阻，間接減少了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的總分泌量，保護了β-內(nèi)酰胺類藥物，還有待證明；研究表明，氟喹諾酮類藥物易與金屬陽離子形成配合物從而影響其生物利用度[11]，烏蕨醇提物中是否含有金屬陽離子，導(dǎo)致與氟喹諾酮類藥物都表現(xiàn)出拮抗作用，還需要進一步的試驗驗證。現(xiàn)階段的研究僅停留在體外抑菌階段，結(jié)果僅可作為初步的用藥參考，烏蕨醇提物在體內(nèi)能否達到較理想的抑菌效果，以及在實際防治中能否作為抗生素的增效劑，還需要進一步的試驗進行探索。

表1 ①號菌株(含CTX-M的大腸桿菌)的單獨用藥和聯(lián)合用藥結(jié)果

表2 ②號菌株(含CTX-M和fosA3基因的大腸桿菌)的單獨用藥和聯(lián)合用藥結(jié)果

注：FICI≤0.5為協(xié)同作用； 0.52為拮抗作用

[1] 李金種.CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶的研究進展[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，28(6)：543-548.

[2] 肖莉春.29種中藥營養(yǎng)價值及對耐藥大腸桿菌抑菌活性研究[D].南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[3] 吳曉寧，張春椿.烏蕨不同提取物體外抑菌作用比較研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(6)：1267-1268.

[4] 吳麗珍，曹性玲，周青，等.烏蕨對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用[J].中藥藥理與臨床，2013，29(5)：84-86.

[5] 池水晶，馮時，王艷紅，等.二甲基亞砜的體外抑菌活性研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2014，14(3)：348-354.

[6] CLSI.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;Twenty-third informational supplement.CLSI document M100-S23[S].Wayne,PA:CLSI，2013.

[7] 趙越，何秀麗，張懷強，等.檢測大腸桿菌群體生長動力學(xué)過程4種方法的比較[J].生物數(shù)學(xué)學(xué)報，2013，28(4)：702-708.

[8] 黎曉強.CTX-M-15型ESBLs的傳播機制和基因環(huán)境的研究進展[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊，2010，31(3)：141-144.

[9] 王喜仁，趙淑堂，孫耀峰.威海市區(qū)CTX-M型具有頭孢他啶水解活性的ESBL是基因型調(diào)查[J].實用檢驗醫(yī)師雜志，2013，5(4)：205-209.

[10] 任冰如.烏蕨化學(xué)成分研究及其資源利用評價[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[11] 陳亮，穆麗璇，續(xù)浩.氟喹諾酮類抗菌藥物與過度金屬離子Cr3+，Mn2+和Fe3+形成配合物配位位置的研究[J].波譜學(xué)雜志，2003，20(1)：23-27.

Study on the Effects of the Ethanol Extraction ofStenolmachusanumChingCombined with Antibiotics against theE.coliwith β-lactamase Gene CTX-M

ZHAO Yu-chuan , WU Yong-ji , LIU Zeng-yuan , SUN Yan-jie , HU Mei ， SI Hong-bin

(College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)

To investigate the antibacterial effect of the ethanol extraction ofStenolmachusanumChingand its combination with antibacterial drugs against theE.coliwith β-lactamase gene CTX-Minvitro, and provide primary references both to the prevention and treatment of thedrug-resistanceE.coliinfection and the further development ofStenolmachusanumChing. To use the ethanol (70% volume faction) to soak the powder ofStenolmachusanumChingfor 7 days at room temperature twice, and then the extractions were evaporated after filtration. The extraction was then dissolved in dimethyl sulfoxide solution (4% volume faction) to make the liquid medicine (0.064 g/mL). The minimal inhibition concentration (MIC) of the ethanol extraction ofStenolmachusanumChingand antibacterial drugs was tested against two strains ofE.coliwithβ-lactamase gene CTX-M using two-fold micro-dilution method. Furthermore, the fractional inhibitory concentrations index (FICI) of the ethanol extractionofStenolmachusanumChingcombined with antibacterial drugs was measured. For No.1 strain, the ethanol extraction ofStenolmachusanumChingcombined withfosfomycinshowed synergistic effect, and the FICI is 0.281; Its combination with ceftriaxone sodium, ceftazidime, cefotaxime sodium, ceftiofur sodium, amoxicillin, sulfamonomethoxine, lincomycin, florfenicol, and rifampicin showed additive effect, and the FICI were 0.563, 0.516, 0.516, 0.563, 0.75, 0.625, 0.625, 0.625, and 0.75, respectively. Its combination with fluoroquinolones antibiotics showed antagonism effect, and the FICI raged from 9 to 65. For No.2 strain, the ethanol extraction ofStenolmachusanumChingcombined withfosfomycin, sulfamonomethoxine, and lincomycin showed synergistic effect, and the FICI were 0.281, 0.375, and 0.5, respectively. Its combination with ceftriaxone sodium, ceftazidime, cefotaxime sodium, ceftiofur sodium, amoxicillin, florfenicol, and rifampicin showed additive effect, and the FICIwere 0.504, 0.516, 0.504, 0.502, 0.504, 0.625, and 0.75, respectively. Its combination with fluoroquinolones antibiotics showed antagonism effect, and the FICI raged from 9 to 65.

StenolmachusanumChing; ethanol extraction ; CTX-M ; combined effect

SI Hong-bin

2015-12-17

廣西自然基金青年基金項目(2012GXNSFBA053052，2013GXNSFAA019070)；廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院科研發(fā)展基金項目(DK201105)；廣西大學(xué)獸醫(yī)一級學(xué)科博士啟動基金項目(2012GXNSFBA053052)；國家自然科學(xué)基金(31460675)；江蘇蘇北科技發(fā)展計劃(BN2016012)

趙雨川(1990- )，男，碩士生，從事中獸藥研究，E-mail：1260539483@qq.com

司紅彬，E-mail：zhuli_2009@163.com

R285.5

A

0529-6005(2017)02-0081-03