李道穩(wěn) , 鄔良賢 ，郭 琳 , 李 斌 , 肖希龍 , 湯樹生

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.龍巖市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，福建龍巖364000)

喹乙醇毒性分子機制研究進展

李道穩(wěn)1, 鄔良賢2，郭 琳1, 李 斌1, 肖希龍1, 湯樹生1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.龍巖市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，福建龍巖364000)

喹乙醇是1965年由德國拜耳公司以鄰硝基苯胺為原料合成的一種喹噁啉類藥物，其化學(xué)名稱為：2-[N-(2-羥基-乙基)-氨基甲酰]-3-甲基-喹噁啉-1,4-二氧化物，又稱喹酰胺醇。我國于 1981 年由北京營養(yǎng)源研究所成功研制喹乙醇。喹乙醇外觀為淡黃色粉末、味苦、無臭；微溶于冷水，易溶于熱水，難溶或不溶于普通有機溶劑。對光較敏感，光照易分解為棕色或深棕色。喹乙醇熔點為 202 ℃～207 ℃，對熱不敏感，在 70 ℃～90 ℃經(jīng)30 min無變化[1]。

本文從喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、細(xì)胞周期阻滯等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來闡述其可能的分子機制，喹乙醇毒理機制的深入研究對于該類藥物的合理、安全使用和新藥研發(fā)均具有重要的指導(dǎo)意義。

1 喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子機制

1.1 喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線粒體途徑 細(xì)胞凋亡是生物體細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在正常生理或病理狀態(tài)下自主發(fā)生的受基因嚴(yán)格調(diào)控的死亡形式。喹乙醇能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是喹乙醇致HepG2細(xì)胞損傷的一個主要途徑：喹乙醇使細(xì)胞內(nèi)ROS增加，ROS會損傷線粒體DNA，進而ROS激活p53。激活后的p53進一步使 Bax /Bcl-2增加，Bax移位聚集在線粒體上，開放線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔。開放的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔和增加的Ca2+濃度促使線粒體膜通透性增加，釋放Cyt C等凋亡因子，引起caspase酶原級聯(lián)激活，活化后的caspase-3促使PARP原酶的剪切，使其失去修復(fù)的能力，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2]。喹乙醇導(dǎo)致HepG2凋亡的可能機制見圖1。

1.2 c-myc基因在喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用 研究表明，c-myc基因在喹乙醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡過程中，起到了促進凋亡的作用，其可能作用原理是c-myc激活了Bax的表達，同時抑制Bcl-2 的表達，產(chǎn)生早期凋亡信號，經(jīng)線粒體途徑引起ROS介導(dǎo)的Cyt C的釋放，從而使細(xì)胞走向凋亡[3]。

1.3 MAPK參與喹乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 p38

圖1 喹乙醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的機制圖[2]

MAPK和JNK信號通路參與喹乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。喹乙醇作為外源刺激進入細(xì)胞，經(jīng)過一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，促使細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，激活JNK和p38 MAPK信號通路，這兩條MAPK通路可通過抑制促凋亡蛋白 Bax、增強抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，緩解線粒體膜損傷，減少Cyt C等凋亡因子由線粒體釋放至胞漿，抑制caspase酶原級聯(lián)激活從而參與抑制細(xì)胞凋亡

[4]

。MAPK參與調(diào)節(jié)喹乙醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的可能作用機制見圖2。

圖2 MAPK信號通路調(diào)節(jié)喹乙醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用機制[4]

1.4 GADD45a在喹乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用 GADD45a在喹乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中扮演重要角色。干擾GADD45a后，顯著降低了喹乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞活性，增加ROS的產(chǎn)生，降低線粒體膜電位，從而促使Bax/Bcl-2增加，隨后導(dǎo)致 Cyt C釋放，Cyt C激活了線粒體凋亡的標(biāo)志物caspase-9，caspase-9的激活導(dǎo)致了凋亡蛋白caspase-3和PARP的剪切，最終導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生[5]，其可能的機制如圖3。

圖3 GADD45a在喹乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用機制[5]

2 喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞自噬分子機制

2.1 JNK信號通路參與喹乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬 喹乙醇通過LC3-II和Beclin 1 表達的上調(diào)，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬。喹乙醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬的具體機制可能與mTOR或 Beclin1相關(guān)途徑有關(guān)，與DAPK無關(guān)。JNK信號通路可能參與了喹乙醇誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞自噬的負(fù)調(diào)控。該信號通路的抑制會導(dǎo)致喹乙醇誘導(dǎo)的自噬水平增強，這可能只是因為 JNK 對自噬的抑制作用的減輕；也可能因為自噬和凋亡都屬于促進細(xì)胞死亡的一種方式，細(xì)胞保護性的JNK通路被抑制后，自噬和凋亡水平均升高；或者因為自噬本身也是促進細(xì)胞生存的機制，JNK通路的抑制導(dǎo)致自噬增強以代償細(xì)胞保護功能。其可能的機制如下圖4。

2.2 TSC2在喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞自噬中的作用 喹乙醇作為外源性刺激能誘導(dǎo)HEK293T細(xì)胞發(fā)生自噬，并具有時間與劑量依賴性。TSC2在喹乙醇誘導(dǎo)HEK293T細(xì)胞自噬中抑制自噬的發(fā)生；TSC2可能介導(dǎo)了喹乙醇誘導(dǎo)HEK293T細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激；并且TSC2可能誘導(dǎo)了喹乙醇導(dǎo)致的HEK239T細(xì)胞凋亡，干擾TSC2后染毒喹乙醇，凋亡顯著降低，過表達 TSC2 后染毒喹乙醇，凋亡顯著升高[7]。

3 喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

喹乙醇呈時間和劑量依賴性誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞阻滯于S期，延緩 S期向G2/M 期轉(zhuǎn)換，進而抑制細(xì)胞的增殖。其可能的調(diào)控機制是：喹乙醇造成的DNA雙鏈斷裂，可能通過以下兩種途徑來調(diào)控周期進程：(1)細(xì)胞啟動：ATM-CHK2/CHK1-CDC25A-CDK2通路，直接作用于S期，造成S期阻滯；(2)c-myc的高表達拮抗p53、p21對G1期的阻滯作用：通過激活cyclinD1、cyclinE、cdk4和cdk6抑制p27的阻滯作用，同時下調(diào)G2/M期相關(guān)的cyclinA和cyclinB1的表達，推進細(xì)胞周期進程，使細(xì)胞通過G1期DNA損傷檢查點，將細(xì)胞阻滯于S期，其具體機制見圖5。

4 總結(jié)與展望

對喹乙醇毒性的認(rèn)識是一個漸進的過程，以上綜述的研究表明，喹乙醇可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、周期阻滯等毒性反應(yīng)，但具體其靶器官、靶細(xì)胞毒性機制的研究尚不深入。近年來研究表明，自由基和線粒體損傷可能是引起該類藥物遺傳毒性的重要原因。已有試驗證明，喹乙醇能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和溶酶體介導(dǎo)的自噬途徑均為外源性化合物重要的毒性作用途徑，該現(xiàn)象提示我們內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能也是喹乙醇攻擊的靶點之一。喹乙醇可通過激活多種生物信號而產(chǎn)生毒性，而各個指標(biāo)之間既相互關(guān)聯(lián)又相互制約。但喹乙醇的毒性機制及分子作用機理仍有待完善，喹乙醇的細(xì)胞毒性不容忽視，其作為飼料添加劑的安全性還有待更多實驗研究進行驗證評價，應(yīng)當(dāng)深入研究其毒性機制為開發(fā)設(shè)計新型高效毒性作用小的抗菌促生長劑奠定堅實的基礎(chǔ)。

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2016-09-14

國家自然科學(xué)基金(31372486)

李道穩(wěn)(1990- )，男，博士生，從事獸醫(yī)藥理及毒理學(xué)研究，E-mail：lidaowen123.fff@163.com

湯樹生，E-mail：tssfj@163.com

S816.7

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0529-6005(2017)02-0065-03