楊 峰 ， 方 英 ， 白 璧 ， 徐春志 ， 陳 紅 ， 彭 屹 ， 袁翠霞

(貴陽市動物疫病預防控制中心， 貴州貴陽550081)

骨髓細胞瘤禽白血病的實驗室診斷

楊 峰 ， 方 英 ， 白 璧 ， 徐春志 ， 陳 紅 ， 彭 屹 ， 袁翠霞

(貴陽市動物疫病預防控制中心， 貴州貴陽550081)

禽白血病是由禽白血病病毒(avianleucosisvirus，ALV)引起的多種腫瘤性疾病的總稱，主要以造血細胞惡性增生為特征，包括淋巴細胞性白血病、成紅細胞性白血病、成髓細胞性白血病、血管瘤病、骨髓細胞瘤病、骨化石病等。由雞分離的ALV 分為A、B、C、D、E、J 6個亞群，在自然條件下，由ALV導致的腫瘤病例主要是A、B亞群引起的，J亞群則主要引起肉用型雞髓樣細胞性腫瘤。自Payne等[1]首次從肉用型雞群中分離并鑒定出ALV J亞群后，該病原已在世界范圍內(nèi)傳播流行，我國于1999年首次報道了商品肉雞感染ALV J[2]亞群，并陸續(xù)在江蘇、內(nèi)蒙古、寧夏、山東和廣東等地中分離鑒定到該病原[3]。

近期，貴州省某鐵腳麻肉雞規(guī)模場所飼53日齡雞出現(xiàn)消瘦，精神委靡，食欲減退，體重下降，雞冠萎縮蒼白，羽毛異常，腹部膨大等疑似J亞群禽白血病癥狀，發(fā)病率達12%，死亡率達5.3%。本試驗通過血清學檢測、病理組織學觀察及分子生物學檢測等方法對該場患病雞進行了確定性診斷。現(xiàn)將診斷結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品 120份不同日齡雞血清樣本，6只病死雞肝臟、腎臟、脾臟組織，均采自貴州省某鐵腳麻肉雞規(guī)模場。

1.2 材料 禽白血病J亞群抗體檢測試劑盒，購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；甲醛、H.E.染料等病理試劑，本實驗室配制保存；參照文獻[4]，在pol基因的3′端和gp85編碼基因的內(nèi)部設計了1對引物H5/H7(引物序列見表1)，引物送上海捷瑞生物工程有限公司合成；PCR擴增試劑，購自天根生化科技(北京)有限公司。

表1 引物序列

1.3 禽白血病J亞群抗體檢測 將待檢樣品以樣品稀釋液進行500倍稀釋，設陰、陽性對照各2孔，每孔加100 μL待檢樣品，封口膜封板后室溫孵育30 min。以350 μL洗滌液洗板5次，每孔加酶標抗體100 μL，室溫孵育30 min后洗滌5次。每孔加入100 μL TMB底物液，室溫下作用15 min終止液終止反應，測定各孔OD650 nm值。待檢樣品S/P比值(S/P=樣品平均值-陰性對照平均值/陽性對照平均值-陰性對照平均值)小于或等于0.6時，待檢樣品判為陽性。

1.4 組織病理學觀察 對出現(xiàn)腫瘤病變或疑似腫瘤的病死雞進行病體剖檢，觀察大體病變并記錄。同時，取肝、腎、脾，以10%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋切片，H.E.染色后鏡檢，觀察組織病理變化。

1.5 分子生物學診斷 按SDS-Proteinase K法提取病死雞肝臟樣本總DNA。建立PCR反應體系50 μL，依次加入10×PCR Buffer 5 μL、MgCl2(25 mmol/L)3 μL、dNTP(10 mmol/L)1 μL、Taq酶(2.5 U)1 μL、上下游引物(20 mmol/L)各1 μL、DNA模板2 μL，滅菌ddH2O 補足。PCR反應按下列條件進行：95 ℃預變性5 min，然后進入35個循環(huán)，94 ℃變性1 min、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，最后72 ℃再延伸10 min。PCR擴增完成以后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 禽白血病J亞群抗體檢測結果 以禽白血病J亞群抗體檢測試劑盒對不同日齡鐵腳麻肉雞血清樣板進行抗體檢測，結果見表2。

由表2可知，該場所飼不同日齡鐵腳麻肉雞均檢測到J亞群禽白血病抗體陽性，其中150日齡為33.3%，220日齡為23.3%，270日齡為13.3%，450日齡為30.0%。初步判定，該場雞群存在ALV J亞群感染情況。

表2 雞群禽白血病J亞群抗體檢測結果

2.2 病死雞剖檢觀察結果 對6只病死雞進行病體剖檢，觀察到：肝臟明顯腫大，幾乎占據(jù)整個腹腔、色變淡，有大小不等的灰白色腫瘤結節(jié)(見中插彩版圖1)；脾顯著腫大，有白色腫瘤病灶，包膜緊張，切面外翻(見中插彩版圖2)；腔上囊萎縮或消失；腸管漿膜而及胰腺表面有灰白色結節(jié)；盲腸扁桃體出血。

2.3 組織病理學診斷結果 采用H.E.染色法，制備肝、腎、脾組織切片，于顯微鏡下進行組織病理學觀察，結果(見中插彩版圖3、4)。

由圖可知，在肝臟切片中可見大量增生的髓細胞樣瘤細胞，在中央靜脈周圍和肝細胞索之間，瘤細胞成簇分布或分散存在，正常的肝細胞索結構被破壞、萎縮或消失，受擠壓的肝細胞發(fā)生空泡變性，胞核模糊淡染，或僅殘留核影，出現(xiàn)典型的核溶解現(xiàn)象。髓細胞樣瘤細胞體積較大，呈圓形或橢圓形，胞核常偏于一側，染色質(zhì)較疏松，胞漿豐富，含有大量嗜酸性顆粒。在肝竇狀隙中，除觀察到瘤細胞浸潤以外，尚發(fā)現(xiàn)數(shù)量不等的淋巴細胞和紅細胞。在腎臟切片中髓細胞樣瘤細胞在血管附近灶狀集聚，或分散存在于腎間質(zhì)中，腎小管上皮細胞呈現(xiàn)腫脹-變性-壞死的不同階段，甚至脫落而成為空泡樣結構。在脾臟切片中鞘動脈周圍也可見少量髓細胞樣瘤細胞浸潤，白髓體積縮小，淋巴細胞稀疏。組織學診斷結果判定為由ALV J亞群所致骨髓細胞瘤禽白血病。

2.4 J亞群禽白血病病毒核酸檢測 以J亞群禽白血病病毒特異性引物H5/H7對6只腫瘤病死雞肝臟所提DNA進行PCR擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖5。

由圖5可知，6只病死雞肝臟所提DNA經(jīng)J亞群禽白血病病毒特異性引物H5/H7檢測，均擴增到545 bp目的條帶，與預計擴增大小相符。進一步表明，該場雞群發(fā)生骨髓細胞瘤禽白血病的病原為ALV J亞群。

圖5 J亞群禽白血病病毒核酸檢測結果

M：200 bp DNA Marker；1:陰性對照； 2：陽性對照； 3-8：病死雞肝臟

3 討論

目前，J亞群禽白血病已呈全球性流行，因該病所致腫瘤和生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[6]。近年來，由ALV J亞群感染所引起骨髓細胞瘤型禽白血病也陸續(xù)在國內(nèi)各地報道[5]。本試驗對貴州省某鐵腳麻肉雞規(guī)模場疑似患病雞群進行了血清抗體檢測，結果顯示，不同日齡雞群中存在ALV J亞群感染情況，J亞群禽白血病抗體陽性率在13.3%～33.3%之間。通過組織病理學診斷，發(fā)現(xiàn)病死雞肝臟切片中有大量增生的髓細胞樣瘤細胞，這與文獻報道一致[6]。并根據(jù)對病死雞肝臟、脾臟與腎臟的分子生物學檢測結果，表明引起該場肉雞疫病的是由ALV J亞群所致骨髓細胞瘤禽白血病。

資料顯示[7]，ALV J亞群感染雞后，除致雞發(fā)生腫瘤疫病外，還能導致雞群發(fā)生嚴重的免疫抑制，使混合感染幾率增大，常見如雞馬立克病病毒、雞傳染性貧血病毒、沙門菌等病原易與ALV J亞群混合感染雞發(fā)病[10]，因此，病雞臨床表現(xiàn)復雜，發(fā)病率和死亡率上升。另外，ALV J亞群易感雞群日齡不斷提前，在肉雞中從最早27日齡發(fā)病已提前到現(xiàn)在的24日齡。因此，在目前臨床上暫無該病有效疫苗的情況下，養(yǎng)禽場應著重從疫病凈化的角度做好防控工作。

[1] Payne L N,Brown S R,Burumstead N,etal．A novel subgroup of exogenous avian leucosis virus in chickens[J].J Gen Virol,1991,72:801-807.

[2] 杜巖,崔治中,秦愛建.從市場商品肉雞中檢出J亞群白血病病毒[J].中國家禽學報,1999,1:1-4.

[3] 高玉龍,邵華斌,羅青平,等.2009年我國部分地區(qū)禽白血病分子流行病學調(diào)查[J].中國預防獸醫(yī)學報,2010,32(1):32-35.

[4] 徐鑌蕊,董衛(wèi)星,余春明.蛋雞J亞群禽白血病的分子生物學診斷[J].病毒學報,2005,21(4):289-292.

[5] 張康,龔振華,劉坤,等.華東北部地區(qū)禽腫瘤性傳染病流行病學調(diào)查[J].中國動物檢疫,2013,30(8):55-57.

[6] 王金玲,丁玉林,趙振華,等.J亞群禽白血病病毒人工感染肉雞病理學及組織嗜性研究[J].中國家禽,2011,33(8):50-52.

[7] 張立軍.J亞群禽白血病及致病機理[J].山東畜牧獸醫(yī),2013,34(10):62-63.

2015-11-16

楊峰(1980-),男,高級獸醫(yī)師,碩士,從事動物防疫工作,E-mail：506031129@qq.com

方英，E-mail:fy6565@126.com

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0529-6005(2017)02-0047-02