劉小蘭 ， 張 飛 ， 賀 筍 ， 杜久斌 ， 張 迪 ， 孫彥軍 ， 王鵬江 ， 李延濤

(新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司， 新疆烏魯木齊830011)

豬流行性腹瀉病毒不同保存方法的比較研究

劉小蘭 ， 張 飛 ， 賀 筍 ， 杜久斌 ， 張 迪 ， 孫彥軍 ， 王鵬江 ， 李延濤

(新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司， 新疆烏魯木齊830011)

選用新疆地區(qū)分離的豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株分別在低溫冰箱(-20 ℃左右)、超低溫冰箱(-80 ℃左右)和液氮(-196 ℃左右)等3種不同保存方法下，保存3、6、9、12個(gè)月，對(duì)保存的病毒分別進(jìn)行TCID50測(cè)定，以及相同劑量口服接種3日齡易感仔豬試驗(yàn)，觀察攻毒后仔豬臨床癥狀及發(fā)病率。結(jié)果表明，豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株保存12個(gè)月，低溫冰箱中病毒TCID50從10-5.0降至10-2.0，發(fā)病率從100%降至0，臨床癥狀較為輕微；超低溫冰箱病毒TCID50從10-5.0降至10-3.7，發(fā)病率從100%降至60%；液氮病毒TCID50從10-5.0降至10-4.7，發(fā)病率從100%降至80%，臨床癥狀較為明顯。因此，液氮可以作為該病毒較長(zhǎng)時(shí)期保存的方法。

豬流行性腹瀉病毒； 病毒保存； 病毒含量(TCID50)； 發(fā)病率

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和對(duì)哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。該病毒是一類(lèi)保存比較困難的病毒，用一般的方法保存，時(shí)間較短，保存不當(dāng)極易造成該病毒的死亡。有效的保存分離毒株是對(duì)PEDV進(jìn)行進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。本文詳細(xì)分析了PEDV在不同溫度下保存不同時(shí)間后其病毒毒力的變化及對(duì)仔豬的感染效果，為更好的研究該病毒以及可行性疫苗等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒種 豬流行腹瀉病毒XJ-DB2株，由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司分離、鑒定、保管和供應(yīng)。

1.2 Vero細(xì)胞 Vero細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由新疆天康畜牧生物技術(shù)有限公司鑒定、保存和供應(yīng)。

1.3 培養(yǎng)基 MEM，購(gòu)自Thermo Scientific科技有限公司。

1.4 設(shè)備 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào)3111)；低溫冰箱；超低溫冰箱，均購(gòu)自Thermo Scientific科技有限公司；液氮罐(型號(hào)CHART)，購(gòu)自查特生物醫(yī)療(成都)有限公司。

1.5 方法

1.5.1 毒源(種)制備 選取本實(shí)驗(yàn)室保存的從新疆地區(qū)某豬場(chǎng)分離得到的豬流行性腹瀉病毒，在病毒的純凈性、特異性檢驗(yàn)后在Vero細(xì)胞上連續(xù)穩(wěn)定傳代至第16代，病毒滴度為10-5.0TCID50/mL。1.5.2 保存方法 將第16代XJ-DB2株分裝至2 mL無(wú)菌離心管中，分3份，每份10管，分別置低溫冰箱、超低溫冰箱和液氮中保存。3種保存方法的保存期設(shè)為3、6、9、12個(gè)月。XJ-DB2株在不同溫度下保存3、6、9、12個(gè)月后取樣，進(jìn)行病毒滴度和對(duì)靶動(dòng)物的致病性的檢測(cè)。

1.5.3 病毒滴度TCID50的測(cè)定

1.5.3.1 準(zhǔn)備細(xì)胞 取出一塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)孔的細(xì)胞鋪成單層，大約60%豐度即可，選取16個(gè)孔作為細(xì)胞對(duì)照。取生長(zhǎng)良好的Vero細(xì)胞用胰酶消化后，用MEM將細(xì)胞密度調(diào)整約為1×106/mL，將調(diào)整后的細(xì)胞加入96孔板中，每孔加100 μL，然后至37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。1.5.3.2 待測(cè)病毒液的稀釋 定期將保存在不同溫度下的豬流行性腹瀉XJ-DB2株病毒液取樣，用MEM進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度分別接種于1.5.3.1中制備的長(zhǎng)滿單層的96孔細(xì)胞版，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)陰性細(xì)胞對(duì)照8孔。1.5.3.3 培養(yǎng) 將96孔培養(yǎng)板放置于36 ℃-37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。

1.5.3.4 結(jié)果判定 取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)，見(jiàn)表1。

表1 Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞感染量 (TCID50)

計(jì)算公式為：距離比例=(高于50%的病毒率的百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%的病毒率的百分?jǐn)?shù)-低于50%的病毒率的百分?jǐn)?shù))：即：=(91.6-50)/(91.6-40)=0.8;

logTCID50=距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)即：=0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8/0.1 mL;

即：將病毒懸液作10-3.8稀釋后，接種細(xì)胞0.1 mL，可以使50%的細(xì)胞產(chǎn)生CPE。

1.5.4 易感動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 定期選取3日齡健康易感仔豬(豬流行性腹瀉病毒抗體為陰性)隨機(jī)分組，設(shè)攻毒組和對(duì)照組，每組5頭。攻毒組口服相同劑量的在不同溫度條件下保存不同時(shí)間的豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株，對(duì)照組口服相同劑量的細(xì)胞培養(yǎng)基。逐日觀察接種仔豬及對(duì)照仔豬的排便情況，并逐頭檢查仔豬的肛門(mén)是否紅腫和有無(wú)糞便污染。若仔豬肛門(mén)紅腫(或被糞便污染)，則記為腹瀉，并根據(jù)糞便形狀按仔豬腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]做好記錄。

2 結(jié)果

2.1 豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株不同溫度，不同保存時(shí)間病毒TCID50檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2、圖1。

2.2 易感仔豬攻毒后試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 仔豬腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 見(jiàn)表3。

表2 病毒檢測(cè)時(shí)間及TCID50結(jié)果

表3 仔豬腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.2 攻毒后仔豬臨床評(píng)分及發(fā)病率 用不同溫度，保存不同時(shí)間的豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株對(duì)易感仔豬進(jìn)行口服攻毒，攻毒后每日觀察仔豬臨床癥狀，并對(duì)試驗(yàn)仔豬進(jìn)行臨床評(píng)分，做好詳細(xì)記錄，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.3 剖檢結(jié)果 易感仔豬攻毒7 d后剖殺，口服在液氮中保存12個(gè)月毒株的仔豬，24 h之后表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、震顫等典型的豬流行性腹瀉癥狀，剖殺后可見(jiàn)小腸腸管擴(kuò)張，內(nèi)容物稀薄，呈黃色，腸壁弛緩，變薄有透明感。低溫冰箱保存6個(gè)月以上攻毒組仔豬的癥狀較為輕微，剖檢結(jié)果與陰性對(duì)照組十分相似。

從表4的結(jié)果可以看出，液氮保存方法能夠保持豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株的高致病率長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月之久，可以作為PEDV的較長(zhǎng)時(shí)期保存的方法；而超低溫冰箱可以作為短期保存PEDV的方法；低溫冰箱保存時(shí)，發(fā)病率及病毒TCID50在短時(shí)間內(nèi)會(huì)明顯降低，所以不作為PEDV的保存方法。若要長(zhǎng)期保存豬流行性腹瀉病毒則應(yīng)保存在液氮中。

表4 不同溫度，保存不同時(shí)間仔豬攻毒后臨床評(píng)分及發(fā)病率

3 討論

本試驗(yàn)中PEDV保存期設(shè)置了12個(gè)月，在液氮中保存12個(gè)月之后的豬流行性腹瀉病毒的TCID50和對(duì)仔豬的高致病率說(shuō)明該病毒在液氮中還可以保存更長(zhǎng)的時(shí)間。病毒保存的目的不僅要保持毒株原有的毒力、優(yōu)良的繁殖性能、穩(wěn)定的形態(tài)特征，并使其遺傳性狀從分離時(shí)或從實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始就一直保持不變[2]。

一種良好的病毒保存方法，首先應(yīng)能保持病毒的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)還須考慮方法的通用性和操作的簡(jiǎn)便性。具體的菌種保藏方法很多，其原理和應(yīng)用范圍各有側(cè)重，優(yōu)缺點(diǎn)也有所差別。在病毒保存方法的研究中，真空冷凍干燥法是目前應(yīng)用最廣泛、效果較好的一種病毒保存方法。該試驗(yàn)在冷凍前未經(jīng)干燥處理，若先冷凍干燥處理再用超低溫或液氮保存，效果可能更好，保存時(shí)間也會(huì)更長(zhǎng)，這將有待進(jìn)一步研究。

[1] Kelly D J,Brien J O,Mccracken K J.Effect of creep feeding on the incidence,duration and severity of post-weaning diarrhoea in pigs[J].Research in Veterinary Science,1990,49(2):223-228.

[2] Kocherhans R,Bridgen A,Ackermann M,etal.Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronaviras(PEDV)genomesequence[J].VirusGenes,2001,23(2):137-144.

2016-04-13

劉小蘭(1982- )，女，獸醫(yī)師，本科，從事動(dòng)物疫苗研發(fā)工作，E-mail：122830140@qq.com

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0529-6005(2017)02-0042-02