郭 銳， 田永祥， 周丹娜， 段正贏， 楊克禮， 劉澤文， 袁芳艷， 劉 威

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部畜禽細菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室 ， 湖北武漢430064 ；2.動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室 ， 湖北武漢430064)

羊口瘡病毒湖北株B2L基因的克隆與遺傳進化分析

郭 銳1,2， 田永祥1,2， 周丹娜1,2， 段正贏1,2， 楊克禮1,2， 劉澤文1,2， 袁芳艷1,2， 劉 威1,2

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部畜禽細菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室 ， 湖北武漢430064 ；2.動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室 ， 湖北武漢430064)

為了分析羊口瘡病毒湖北株(ORFV-HB-YX株)B2L基因遺傳變化規(guī)律，參照GenBank公布的ORFV-B2L基因序列設(shè)計特異性引物，對ORFV-HB株B2L基因進行PCR擴增、克隆、測序以及遺傳進化分析。結(jié)果顯示，B2L基因PCR擴增產(chǎn)物大小為1 137 bp，編碼379個氨基酸，系統(tǒng)進化樹顯示HB-YX株與GenBank參考毒株的核苷酸序列同源性為97.0%～99.0%，與福建FJ-GS株同源性高達99%親緣關(guān)系最近，屬于同一分支。

羊口瘡病毒 ； B2L基因 ； 克隆 ； 遺傳進化分析

羊口瘡(ORF)又稱羊傳染性膿皰口炎或羊傳染性膿皰等，是由羊口瘡病毒(orfvirus,ORFV )所引起的一種綿羊和山羊的高度接觸性人獸共患傳染病，也會感染其他野生反芻動物如鹿、麝牛等，以羔羊最為易感[1]。近年來，羊口瘡在湖北省境內(nèi)臨床病例呈逐漸上升趨勢，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和結(jié)成疣狀結(jié)痂為特征[2]，同時容易繼發(fā)細菌感染，如：葡萄球菌、鏈球菌和變形桿菌等，以羔羊發(fā)病為主，死亡率嚴重的可達30%。

ORFV的基因組結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，為線性dsDNA，其長度為134～139 kb。目前公認的ORFV基因組共包含約130多個基因，由兩個相同的反向末端重復(fù)區(qū)(ORFs 001～008和 ORF112～134)和中央編碼區(qū)(ORFs 009～111) 組成。B2L基因分別位于羊口瘡病毒11個完整開放閱讀框，高度保守，編碼42 kD蛋白。42 kD蛋白是病毒囊膜的主要成分之一，能刺激機體產(chǎn)生強烈的抗體反應(yīng)，并能引起淋巴細胞增殖。該蛋白與痘苗病毒p37k蛋白的氨基酸同源性達42%。用痘苗病毒在羊體內(nèi)表達此蛋白能刺激羊只產(chǎn)生強烈的抗體反應(yīng)，并刺激淋巴細胞釋放。雖然ORFV以細胞免疫為主，但國內(nèi)外學(xué)者仍高度重視該蛋白良好的免疫原性，一些研究者用B2L 基因與病毒囊膜亞單位中的其他保護性抗原基因進行重組，以期獲得能對機體產(chǎn)生有效保護的基因工程苗[3]。國內(nèi)王廷璞等通過B2L基因與pGEM-4Z載體重組，已篩選出具有較高表達水平且能傳代的重組菌[4]。本試驗針對HB-YX株的B2L基因進行分子特征分析，旨在了解HB-YX株與國內(nèi)毒株及國際毒株間的差異，以便深入了解羊口瘡貴州株的分子特性，有助于闡明ORFV致病機制與新型疫苗研究,有助于ORF的綜合防控。

1 材料與方法

1.1 材料 羊口瘡病毒湖北株(HB-YX株)由本實驗室保存；pMD18-T載體、DNA限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、rTaqDNA、E.coliDH5α聚合酶，購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 病毒DNA的提取 按照DNA提取試劑盒說明書操作提取病毒DNA并-20 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中公布的B2L基因序列(登錄號：DQ184476)并參考文獻設(shè)計1對特異性引物，上游引物P1：5′-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC-3′；下游引物P2：5′-CCAAGCTTTTAATTTATTGGCTTGCAGAACT-3′，預(yù)期擴增片段大小為1 100 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 HB-YX株B2L基因的擴增 用1.2提取的DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系體積為50 μL，其中10 μmol/L濃度的上下引物各1 μL，模板5 μL，2×EasyTaqPCR Mix 25 μL，剩下添加ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，68 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定反應(yīng)體系為10 μL，依次加入PCR產(chǎn)物5 μL、pMD18-T載體1 μL、連接緩沖液4 μL，16 ℃連接4 h。取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用DH5α感受態(tài)細胞，涂于含氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單菌落接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。用菌液提取質(zhì)粒，進行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。將酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，利用基因分析軟件MegAlign5.0對測序結(jié)果進行分析，參考毒株信息(見表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HB-YX株B2L基因的擴增 進行PCR擴增后得到1 137 bp的片段，與預(yù)期相符(見圖1)。

表1 參考毒株信息

圖1 HB-YX株B2L基因PCR擴增電泳圖

M：DL-2 000 Marker； 1：羊口瘡病毒

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 提取重組質(zhì)粒pMD18-T-B2L后，選用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，獲得兩條大小為2 692 bp和1 137 bp左右的基因片段，分別與預(yù)期基因片段大小相符(見圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定

M,DL-5 000 Marker；1，重組質(zhì)粒pMD18-T-B2L

2.3 HB-YX-B2L基因片段的基因氨基酸序列同源性分析 將HB-YX株和GenBank中公布的23個不同ORF毒株的B2L基因氨基酸序列用MegAlign 5.0軟件進行同源性在97.0%～99.0%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株與福建FJ-GS株同源性高達99%親緣關(guān)系最近，為同一分支(見圖 3)。

3 討論

近些年以來，養(yǎng)羊在湖北省養(yǎng)殖業(yè)的比重日益增加，截止到2014年，湖北省山羊存欄達469.89萬只，羊肉產(chǎn)量達8.61萬噸。羊口瘡是一種人獸共患病，同時也是養(yǎng)羊過程中的高發(fā)疫病之一。該病對羔羊危害最大，主要原因是羔羊機體免疫力下降，在經(jīng)受外界刺激情況下此時山羊體內(nèi)已經(jīng)受羊口瘡病毒隱性感染，極易出現(xiàn)排毒現(xiàn)象，導(dǎo)致羊口瘡的暴發(fā)，死亡率可高達30%以上。目前尚無治療羊口瘡特效藥，對該病的預(yù)防工作就顯得尤為重要。本人通過總結(jié)大量臨床病例，在羔羊產(chǎn)后1周時間內(nèi)，每天檢查1次口腔，只要發(fā)現(xiàn)紅色小包立即注射抗生素(如頭孢曲松)，按照使用劑量1天兩次，連用3 d，即可有效控制疫情。初期在口腔內(nèi)難以發(fā)現(xiàn)病灶，一旦錯過有效治療期，治療效果將大打折扣。

雖然ORFV以細胞免疫為主，但國內(nèi)外學(xué)者仍高度重視該蛋白良好的免疫原性，一些研究者用B2L基因與病毒囊膜亞單位中的其他保護性抗原基因進行重組，以期獲得能對機體產(chǎn)生有效保護的基因工程苗[3]。國內(nèi)王廷璞等通過B2L基因與pGEM-4Z載體重組，已篩選出具有較高表達水平且能傳代的重組菌[4]。

本試驗成功克隆出了HB-YX株B2L基因，序列全長為1 137 bp，通過與國內(nèi)外已公布序列對比發(fā)現(xiàn)，總的來說ORF-B2L基因同源性在97.0%～99.0%，HB-YX株與福建FJ-GS株同源性最高達99.0%，同屬于一個分支，通過核苷酸序列對比發(fā)現(xiàn)存在一定的基因突變現(xiàn)象，突變主要集中在個別位點1～3個堿基，沒有出現(xiàn)本人之前檢測的HB-YX株F1L基因存在的連續(xù)12個堿基缺失的情況[5]。本試驗闡明了湖北省羊口瘡流行毒株的B2L基因變異情況，為進一步闡明湖北省羊口瘡病毒遺傳變化規(guī)律提供了依據(jù)，也為今后新的ORF疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

[1] 殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2008:423-445.

[2] Abrahao J S,Campos R K,Trindade G S,etal.Detection and phylogenetic analysis of Orf virus from sheep in Brazil:a case report[J].Virol J,2009,6:47

[3] 楊海波,賀志昊，劉昱成，等.羊口瘡病毒新疆野毒株SHZ1 B2L和F1L基因的克隆及遺傳進化分析[J].石河子大學(xué)學(xué)報2013,31(3):323-327.

[4] 趙魁.羊傳染性膿皰病毒重組DNA疫苗的構(gòu)建與實驗免疫研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[5] 郭 銳,田永祥,周丹娜,等.羊口瘡病毒湖北株F1L基因的克隆與遺傳進化分析[J].中國草食動物科學(xué),2015,35(6):31-33.

Cloning and Phylogenetic Analysis of B2L gene of orf virus isolated in Hubei

GUO Rui1,2, TIAN Yong-xiang1,2, ZHOU Dan-na1,2, DUAN Zheng-ying1,2,YANG Ke-li1,2， LIU Ze-wen1,2， YUAN Fang-yan1,2， LIU Wei1,2

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Hubei Academy of Agricultural Science,key laboratory of prevention and control agents for animal bacteriosis (ministry of Agriculcure), Wuhan 430064,China; 2.Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding, Wuhan 430064, China)

In order to analyze the orf virus Hubei strain (ORFV-HB-YX strain) genetic variation of B2L gene,specific primers were designed for-B2L ORFV gene based on the sequence published in GenBank,B2L gene of ORFV-HB strain was amplified,cloned and sequenced,and the genetic analysis of B2L gene was carried out.Results showed that the PCR product of gene B2L was 1137bp.encoding 379 amino acids,Phylogenetic tree showed that the homology of nucleotide sequence of HB-YX strain and GenBank strain was 97.0%～99.0%,and the homology was 99% when compared with the Fujian FJ-GS strain. HB-YX strain and the Fujian FJ-GS strain belong to the same branch.

Orf virus ; B2L gene ; clone ; phylogenetic analysis

TIAN Yong-xiang

2016-04-29

湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項目(2016-620-000-001-026)；動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室開放課題項目(2016ZD150)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303035)

郭銳(1981-)，男，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病防控研究，E-mail：hlguorui@163.com

田永祥，E-mail：tyxanbit@163.ocm

S852.65

A

0529-6005(2017)02-0037-03