邱 薇， 王文博， 胡挺松， 余 靜， 郭 平， 鄭 穎， 張富強(qiáng)， 范泉水

(中國人民解放軍成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心 ， 云南昆明650118)

恒河猴源犬瘟熱病毒N、F基因的克隆與序列分析

邱 薇， 王文博， 胡挺松， 余 靜， 郭 平， 鄭 穎， 張富強(qiáng)， 范泉水

(中國人民解放軍成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心 ， 云南昆明650118)

為了進(jìn)一步明確引起恒河猴類麻疹綜合征的病原體及其來源，對恒河猴源犬瘟熱病毒的N、F全基因進(jìn)行了克隆和序列分析。得到全長1 572 bp的N基因和2 080 bp的F基因，測序后分別與不同CDV毒株的N、F基因核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行分析，N基因核苷酸(氨基酸)與CDV疫苗株Onderstepoort、vaccine x、標(biāo)準(zhǔn)野毒株A75-17同源性分別為93.6%(96.9%)、97.3%(99.0%)和97.3%(99.0%)；F基因核苷酸(氨基酸)與上述毒株同源性分別為91.0%(97.8%)、94.9%(98.6%)和94.4%(97.9%)。N、F基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，恒河猴CDV毒株與黑龍江狐貍毒株(CDV-FOX-HLJNM)遺傳關(guān)系較近，與其他分離株遺傳關(guān)系相對較遠(yuǎn)。本研究從分子水平上證明了引起恒河猴發(fā)病的病原體為一株CDV野毒株，而非疫苗株。

恒河猴 ； 犬瘟熱病毒 ； N基因 ； F基因 ； 序列分析

The clone and sequence analysis of the N and F genes ofcanine

distemper virus in rhesus monkey

犬瘟熱病毒(CDV)是當(dāng)前對我國養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護(hù)業(yè)危害最大的犬瘟熱的病原，經(jīng)常引起大批犬、貂、狐等動物發(fā)病，病死率30%～80%，雪貂高達(dá)100%，經(jīng)濟(jì)損失慘重。隨著生態(tài)環(huán)境的改變、動物和病毒的進(jìn)化，CDV自然感染的動物范圍還有不斷擴(kuò)大的趨勢，尤其是靈長類動物的感染[1-2],使其危害也越來越大。本研究對類麻疹綜合征死亡的恒河猴臟器中擴(kuò)增的N和F基因進(jìn)行了克隆和測序分析，進(jìn)一步明確了引起恒河猴類麻疹綜合征的病原體—犬瘟熱病毒為一株CDV野毒株，而非疫苗株。

1 材料與方法

1.1 材料 CDV弱毒疫苗為日本犬瘟熱病毒疫苗株，本實(shí)驗(yàn)室保存；病料組織取自某動物園死亡的恒河猴肝組織，液氮保存。DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

病毒RNA/DNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、pMD18-T載體，均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、質(zhì)粒(小量)抽提試劑盒，購自上海華舜試劑有限公司；引物合成、純化及測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 參照已發(fā)表的CHV的N、F基因序列，設(shè)計(jì)合成兩對引物CDV-C-Nf/r和CDV-C-Ff/r，分別擴(kuò)增全長N基因和F基因(見表1)。用ddH2O按20 pmol/μL稀釋，-20 ℃凍存。

表1 CDV N基因和F基因RT-PCR及克隆引物

1.3 N、F基因的克隆 采用病毒RNA/DNA提取試劑盒抽提猴肝組織總RNA，以此RNA為模板，用一步法RT-PCR試劑盒及設(shè)計(jì)合成的引物分別進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，MgCl210 μL，dNTP Mixture 5 μL，RNase Inhibitor 1 μL，AMV Reverse Transcriptase XL 1 μL，AMV-OptimizedTaq1 μL，上、下游引物各1 μL，RNA模板5 μL，dH2O 20 μL，總體積50 μL。RT-PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min后，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取5 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物回收后連接到T載體中。1.4 測序及序列分析 陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序并拼接，應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對與分析。

2 結(jié)果

2.1 CDV N、F基因的擴(kuò)增 RT-PCR獲得大小分別為1 572 bp和2 080 bp的兩個片段，與N、F全基因理論值相符(見圖1)。

圖1 恒河猴CDV-N/F全基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

1：F基因陽性對照； 2：CDV-C-Ff/r； 3：CDV-C-Nf/r陽性對照；4：CDV-C-Nf/r； 5：Vero細(xì)胞陰性對照； M：DL-2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)

2.2 CDV N、F全基因序列同源性分析 猴源CDV N全基因核苷酸(氨基酸)與CDV疫苗株Onderstepoort、vaccine x、標(biāo)準(zhǔn)野毒株A75-17同源性分別為93.6%(96.9%)、97.3%(99.0%)和97.3%(99.0%)，與國內(nèi)外流行的部分毒株同源性介于92.8%～98.7%(96.9%～100%)之間。F全基因核苷酸(氨基酸)與CDV疫苗株Onderstepoort、vaccine x、標(biāo)準(zhǔn)野毒株A75-17同源性分別為91.0%(97.8%)、94.9%(98.6%)和94.4%(97.9%)，與國內(nèi)外流行的部分毒株同源性介于91.0%～97.4%(96.2%～100%)之間。

2.3 CDV N、F全基因系統(tǒng)發(fā)育分析 猴源CDV N/F全基因核苷酸序列與國內(nèi)外已知代表性毒株序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，該CDV毒株與黑龍江(HLJNM)狐貍分離毒株遺傳關(guān)系較近，與其他分離株及疫苗株遺傳關(guān)系相對較遠(yuǎn)(見圖2)。

3 討論

犬瘟熱病毒自然感染的動物范圍不斷擴(kuò)大，其危害也越來越大。特別是近年來犬瘟熱在非人靈長類動物中的暴發(fā),引發(fā)了人們對其可能感染人類的潛在危害的思考。首次報道非人靈長類動物感染犬瘟熱病毒是Yoshikawa等[3]曾對從野外捕獲的22只日本獼猴進(jìn)行了長達(dá)1年半的隔離。試驗(yàn)結(jié)果表明，這次日本獼猴發(fā)生的是CDV感染，而不是MV及其他麻疹病毒屬病毒感染，傳染源可能來自獸醫(yī)院就診的犬[4-5]。2008年前后，中國和日本的恒河猴先后暴發(fā)犬瘟熱[1-2,6]，使犬瘟熱病毒的跨種傳播研究成為了研究的熱點(diǎn)[7]。

犬瘟熱病毒基因組編碼6個蛋白[8]，N蛋白是核衣殼主要成分，保守性較強(qiáng)，野毒株與疫苗株Onderstepoort的N蛋白及其基因的同源性分別為95.2%和93.2%，氨基酸序列差別最大的區(qū)域是N端和C端，CDV強(qiáng)毒株N末端可變區(qū)氨基酸的改變影響不大，C末端結(jié)構(gòu)的變化能導(dǎo)致M蛋白對核衣殼的吸附作用的改變，強(qiáng)弱毒株C末端的不同能夠?qū)е虏《镜难b配、囊膜的形成和病毒在細(xì)胞表面釋放的不同[9-10]。F蛋白介導(dǎo)囊膜和細(xì)胞膜融合，是感染性病毒粒子進(jìn)入宿主細(xì)胞所必需的，CDV野毒株與疫苗株F蛋白及基因的同源性分別為95.7%和90.1%，F(xiàn)蛋白的13個半胱氨酸殘基和4個潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)完全保守,F蛋白存在高度的表位同源性[11-12]。因此我們選擇這兩個基因作為研究對象，研究結(jié)果進(jìn)一步說明恒河猴發(fā)病的病原體為CDV或其新的變異株，該毒株與黑龍江分離株狐貍毒株(CDV-FOX-HLJNM)遺傳關(guān)系較近，由此可推測恒河猴飼養(yǎng)場中犬瘟熱的傳染源可能是由附近的犬或犬科動物傳入的野毒株，而非疫苗株。本研究為恒河猴飼養(yǎng)場對暴發(fā)類麻疹綜合征的恒河猴的治療提供了一定的參考依據(jù)，同時也提示恒河猴的飼養(yǎng)和繁殖單位應(yīng)加強(qiáng)對犬瘟熱的防控，以減少恒河猴的類似感染及死亡所造成的經(jīng)濟(jì)損失。

[1] Sun Z,Li A,Ye H,etal.Natural infection with canine distemper virus in hand-feeding Rhrsus monkeys in Chain[J].Vet Microbiol,2010,141(9):374-378.

[2] Qiu W,Zheng Y,Zhang S,etal.Canine distemper outbreak in rhesus monkeys Chain[J].Emerg Infect Dis,2011,17(8):1541-1543.

[3] Yoshikawa Y,Ochikubo F,Matsubara Y,etal.Natural infection with canine distemper virus in a Japanese monkey(Macaca fuscaca)[J].Vet Mircrobiol,1989,20(3):193-205.

[4] Nagata T,Ochikubo F,Yoshikawa Y,etal.Encephalitis induced by a canine distemper virus in squirrel monkeys Y,etal.Natural infection with canine distemper virus in a Japanese monkey(Macaca fuscaca)[J].J Med Primatol,1990,19(1):137-149.

[5] Morikawa S,Fukushi S,Kurane I,etal.Outbreak of deadly canine distemper virus infection among imported cynomolgus (crab-eating) monkeys[J].IASR,2008,29(11):315(in Japanese).

[6] Kouji S,Noriyo N,Yasushi A,etal.Lethal canine distemper virus outbreak in cynomolgus monkeys in Japan in 2008 [J].J Virol,2013,87(2):1105-1114.

[7] Kouji S,Tomoki Y,Fumio S,etal.Canine distemper Virus associated with a lethal outbreak in monkeys can readily adapt to use human receptors[J].J Virol,2013,87(12):7170-7175.

[8] Gassen U,Collins F M,Duprex W P,etal.Establishment of a rescue system for canine distemper virus[J].Virol,2000,74(22):10737-10744.

[9] Yoshida E,Iwatsuki K,Miyashita N,etal.Molecular analysis of the nucleocapsid protein of recent isolates of canine distemper virus in Japan[J].Vet-Microbiol,1998,16,59(2-3):237-244.

[10] Baron M D,Barrett T.Sequencing and analysis of the nucleocapsid (N) and polymerase (L) genes and the terminal extragenic domains of the vaccine strain of rinderpest virus [J].General Virology,1995,76 (3):593-602.

[11] Iwatsuki K,Miyashita N,Yoshida E,etal.The nucleotide and predicted amino acid sequence of the fusion protein of recent isolates of canine distemper virus in Japan[J].Vet-Med-Sci,1998,60(3):381-385.

[12] Sheshberadaran H,Norrby E,McCullough K C,etal.The antigenic relationship between measles,canine distemper and rinderpest viruses studied with monoclonal antibodies[J].Gen-Virol,1986,67 (7):1381-1392.

QIU Wei， WANG Wen-bo， HU Ting-song， YU Jing， GUO Ping， ZHENG Ying，

ZHANG Fu-qiang, FAN Quan-shui

(Center for Disease Control and Prevention of Chengdu Military Region ， Kunming 650118 ， China)

The full-length N and F genes of CDV in rhesus monkey were cloned and sequenced.The full length of N gene and F gene was 1572 bp and 2080 bp,respectively.The results indicated that the homology of the nucleotides(and amino acids) of the N gene with CDV vaccine Onderstepoort vaccine x and standard wild strain A75-17 were 93.6%(96.9%)，97.3%(99.0%) and 97.3%(99.0%)，respectively.The homology of the nucleotides(and amino acids) of the F gene with CDV vaccine Ondersteport and vaccine x and standard wild strain A75-17 were 91.0%(97.8%)、94.9%(98.6%)and 94.4%(97.9%),respectively.The phylogenic analysis showed that the CDV of rhesus monkey had close relationship with Fox strain of Heilongjiang(CDV-FOX-HLJNM).The result proved that the CDV in rhesus monkey was a wild strain,but not a vaccine strain.

Rhesus monkey ； Canine distemper virus ； Nucleocapsid protein gene ； Fusion protein gene ； Sequence analysis

FAN Quan-shui

2016-03-16

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303042)

邱薇(1971-)，女，研究員，博士，主要從事動物病毒學(xué)、分子生物學(xué)研究，E-mail:qiuwei1971@126.com

范泉水，E-mail:fqs168@126.com

S854.4+3

A

0529-6005(2017)02-0026-03