王澄林，張勛，陳抒云，黃澤豪，朱志靈，林羽（.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350；.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350）

金線蓮總黃酮的最佳超聲提取工藝

王澄林1，張勛1，陳抒云1，黃澤豪1，朱志靈1，林羽2
（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122）

目的優(yōu)化金線蓮總黃酮的超聲提取工藝。方法用紫外-可見分光光度比色法測(cè)定黃酮含量，用L9（34）正交試驗(yàn)，考察乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)金線蓮總黃酮含量測(cè)定的影響。結(jié)果最優(yōu)的提取工藝為40倍量的95%乙醇超聲提取3次，每次40 min，金線蓮的總黃酮提取率為2.06%。結(jié)論乙醇濃度對(duì)總黃酮的提取率有顯著影響，經(jīng)優(yōu)化的提取工藝，操作簡單，提取效率較高，方法穩(wěn)定、可行。

金線蓮；總黃酮；超聲提??；最佳工藝；正交設(shè)計(jì)

我們用正交試驗(yàn)法，以金線蓮總黃酮含量為指標(biāo)，超聲提取為方法，考察不同因素對(duì)金線蓮總黃酮含量測(cè)定的影響，以確定其最佳提取工藝。

1 材料與儀器

1.1 藥材金線蓮樣品由福建虎伯寮生物集團(tuán)有限公司提供，3個(gè)月全株苗，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪副教授鑒定為蘭科開唇蘭屬的福建金線蓮Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.。

1.2 試劑蘆丁對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：10080—200707）；亞硝酸鈉（上海聯(lián)試化工試劑有限公司）；硝酸鋁（上海展云化工有限公司，批號(hào)：0909179）；氫氧化鈉、甲醇、乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20080605、20150209、20150126）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制），試劑均為分析級(jí)。

1.3 儀器CP214型分析天平（美國奧豪斯儀器上海有限公司）；KQ—500DE超聲提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DLSB—5／20低溫冷卻循環(huán)泵、SHB—III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE—2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TDL80—2B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UV—9100紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取蘆丁對(duì)照品5 mg置于25 mL瓶中，加15 mL甲醇超聲溶解后定容至刻度，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 供試品溶液的制備稱取干燥、粉碎過60目篩的金線蓮粉末0.5 g置于25 mL具塞三角燒瓶中，按L9（34）正交設(shè)計(jì)，加入20 mL 95%乙醇浸泡過夜，超聲提取功率為300 W。3 000 r／min離心15 min，過濾，提取3次，每次40 min，合并濾液，45℃真空減壓濃縮至干，加適量甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL瓶中，既得。

2.3 金線蓮總黃酮含量測(cè)定吸取供試品溶液5 mL置25 mL瓶中，加1 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻，放置6 min，再加1 mL 10%硝酸鋁，搖勻，放置6 min，最后加10 mL 4%NaOH溶液，混勻，甲醇定容，放置15 min。以不加蘆丁對(duì)照品的試劑為空白對(duì)照，在最大吸收波長501 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算總黃酮的提取率。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1、2、3、4、5、6 mL分別置于25 mL瓶中，配制不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光度值。

2.4.2 精密度考察40倍量的95%乙醇超聲提取3次，每次40 min，提取金線蓮總黃酮，得樣品溶液。在相同條件下平行測(cè)定5次吸光度值，計(jì)算RSD。

2.4.3 穩(wěn)定性考察將2.4.2項(xiàng)的樣品溶液每隔10 min測(cè)定1次吸光度值，連測(cè)5次，計(jì)算RSD。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn)取5個(gè)25 mL瓶，分別加入5 mL已知含量的樣品溶液和2.5 mL濃度為0.2 mg／mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照2.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光度值，平行測(cè)3次，計(jì)算總黃酮含量，得平均回收率和RSD。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)考察了提取方法（回流提取和超聲提?。?、提取溶劑（甲醇和乙醇）、浸泡時(shí)間（6、12、18、24 h）以及溶劑濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)，確定了這4個(gè)主要因素，同時(shí)對(duì)4個(gè)主要因素進(jìn)行水平篩選，確定了3個(gè)水平，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 最大吸收峰見圖1。光譜掃描結(jié)果表明在501 nm處有最大吸收峰。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

圖1 光譜掃描曲線

結(jié)果表明蘆丁濃度在0.008～0.048 mg／mL，吸光度值與濃度呈良好的線性關(guān)系。

3.3 精密度考察5次測(cè)定的吸光度值為0.251、0.251、0.252、0.251、0.253，計(jì)算得吸光度的RSD為0.35%，表明精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性考察每隔10 min測(cè)定的吸光度值為0.252、0.252、0.250、0.249、0.249，計(jì)算得吸光度的RSD為0.52%，表明樣品溶液在1 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

3.5 加樣回收率見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)（n＝3）

結(jié)果表明平均加樣回收率為101.04%，RSD為4.5%。

3.6 正交試驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。

表3結(jié)果表明，A項(xiàng)極差最大，C項(xiàng)極差最小，即4個(gè)因素對(duì)金線蓮總黃酮提取率的影響程度為：A＞D＞B＞C。結(jié)果表明，乙醇濃度對(duì)金線蓮總黃酮提取率影響最大，提取次數(shù)次之，提取時(shí)間影響最小。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

表4結(jié)果表明，乙醇濃度對(duì)金線蓮總黃酮提取率有顯著影響，其它3個(gè)因素?zé)o顯著性影響。綜合極差和方差分析的結(jié)果，提取金線蓮總黃酮的最佳工藝條件為A1B3C1D3，即40倍量的95%乙醇超聲提取3次，每次40 min。

3.7 驗(yàn)證試驗(yàn)為驗(yàn)證該工藝的穩(wěn)定性和合理性，以最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表5結(jié)果表明，金線蓮總黃酮提取率平均值為2.06%，RSD為1.45%，此結(jié)果表明該提取工藝條件穩(wěn)定可行。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過L9（34）正交試驗(yàn)，最終確定金線蓮總黃酮的最佳提取工藝為40倍量的95%乙醇超聲提取3次，每次40 min，提取功率300 W。研究結(jié)果表明，用超聲提取法在保證提取效率的前提下，簡化了文獻(xiàn)報(bào)道的溶劑回流提取法對(duì)金線蓮總黃酮類的提取工藝，操作方法簡便，提取效率較高，建立的超聲提取金線蓮黃酮類成分的最佳工藝條件，有助于金線蓮檢測(cè)質(zhì)量的控制。

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R284.2

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1000-338X（2017）01-0040-03

2016-09-08

福建省炮制傳承基地建設(shè)重點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)（X2014131-學(xué)科）。

王澄林（1991—），女，2014級(jí)中藥學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事藥物分析與質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

林羽（1966—），男，主任藥師。E-mail：yulam@163.com