張鈴，方翌，蔡巧燕，林珊，魏麗慧，彭軍（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

半枝蓮阻滯人結(jié)腸癌細(xì)胞周期的機(jī)制

張鈴，方翌，蔡巧燕，林珊，魏麗慧，彭軍
（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

目的研究半枝蓮氯仿極性部位提取物（ECSB）阻滯人結(jié)腸癌細(xì)胞周期的機(jī)制。方法用ECSB干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8、SW620，檢測(cè)其細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果ECSB干預(yù)SW620細(xì)胞后，其p16表達(dá)上升，PCNA表達(dá)下降；ECSB干預(yù)HCT-8細(xì)胞后，Cyclin D1、CDK2、CDK4表達(dá)下降。結(jié)論ECSB通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

半枝蓮氯仿極性部位提取物；結(jié)腸癌；細(xì)胞周期

結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，目前治療CRC的常見方法有手術(shù)、放療、化療、靶向治療等，但均未取得突破性進(jìn)展，主要原因是腫瘤細(xì)胞具有無(wú)限增殖能力，容易產(chǎn)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，歸肺、肝、腎、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、活血化瘀、利尿消腫的功效［1］。臨床證實(shí)半枝蓮與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用，可明顯減輕患者放化療的副作用，改善生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存時(shí)間。半枝蓮對(duì)腫瘤的療效確切，但由于組分復(fù)雜使得其抗腫瘤的有效成分仍然未知。我們前期研究將半枝蓮萃取為氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚，初步確定氯仿極性部位提取物（ECSB）為4個(gè)部位中最有效的抗腫瘤部位［2］。本研究從ECSB阻滯人結(jié)腸癌細(xì)胞周期方面進(jìn)行研究，以確定半枝蓮的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞來(lái)源結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620（上海中科院細(xì)胞庫(kù)）；HCT-8（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥物與試劑半枝蓮購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂；L-15、RPMI-1640培養(yǎng)基（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；胰蛋白酶、胎牛血清、Trizol、Super-Script III First-Strand Synthesis System試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix試劑盒（美國(guó)Fermentas公司）；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；引物合成、DEPC處理水（上海生物工程有限公司）；Taq酶（德國(guó)Sigma公司）；GenomeLabTM Gexp start kit試劑盒、分離膠、甲酰胺（SLS）、DSS-400（美國(guó)Beckman公司）。

1.3 主要儀器CO2培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-rad公司），GenomeLabTM Gexp遺傳分析系統(tǒng)（美國(guó)Beckman公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 半枝蓮不同極性部位提取物的制備制備方法見文獻(xiàn)［2］。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620和HCT-8分別接種到250 mL的培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 μg／mL鏈霉素的L-15和RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.3 RT-PCR檢測(cè)SW620細(xì)胞基因表達(dá)SW620以5×105個(gè)／mL接種于6孔板中，加入25、50、75 μg／mL ECSB干預(yù)24 h后收集細(xì)胞。用Trizol提取總RNA，-20℃保存?zhèn)溆?。用SuperScript III First-Strand Synthesis System試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA通過(guò)PCR擴(kuò)增得到p16（多腫瘤抑制因子）、PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）基因，以GAPDH為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增用Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix試劑盒，具體操作按試劑盒說(shuō)明書。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80～100 V。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。

2.4 Gexp技術(shù)檢測(cè)HCT-8細(xì)胞基因表達(dá)HCT-8以2×105個(gè)／mL接種于6孔板中，加入150 μg／mL ECSB干預(yù)48 h后收集細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，-20℃保存?zhèn)溆?。引物配制：將要檢測(cè)的所有基因的下游引物混合，配制終濃度為500 nmol／L的混合液。將要檢測(cè)的所有基因的上游引物混合，配制終濃度為200 nmol／L的混合液。逆轉(zhuǎn)錄時(shí)用下游混合引物，PCR時(shí)用上游混合引物，其余加樣按試劑盒說(shuō)明書操作。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃1 min，42℃1 h，95℃5 min，4℃hold。將獲得的cDNA進(jìn)一步通過(guò)PCR擴(kuò)增得到Cyclin D1（細(xì)胞周期素D1）、CDK2（細(xì)胞周期素依賴性激酶2）、CDK4（細(xì)胞周期素依賴性激酶4）基因。PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃1 min（94℃30 s，55℃30 s，70℃1 min）×35個(gè)循環(huán)。用SLS稀釋Marker（DSS-400），PCR產(chǎn)物經(jīng)稀釋后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，用默認(rèn)分析參數(shù)對(duì)毛細(xì)管電泳的結(jié)果進(jìn)行片段分析。以TBP、GAPDH、CYPLOPHOH為參考基因，將其峰值求幾何均數(shù)，各基因的峰值與該幾何均數(shù)的峰值相除，得到各基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1、表1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)SW620細(xì)胞在ECSB干預(yù)后其p16、PCNA的mRNA表達(dá)量

表1 Gexp檢測(cè)HCT-8細(xì)胞在ECSB干預(yù)后其Cyclin D1、CDK4、CDK2的mRNA表達(dá)量

表1 Gexp檢測(cè)HCT-8細(xì)胞在ECSB干預(yù)后其Cyclin D1、CDK4、CDK2的mRNA表達(dá)量

注：與0 μg／mL組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01。

ECSB濃度150 μg／mL組0 μg／mL組CDK2 0.41±0.111）0.70±0.28 n 3 3 Cyclin D1 1.73±0.602）17.45±4.58 CDK4 1.78±0.222）6.04±0.50

4 討論

4.1 細(xì)胞周期中可以影響細(xì)胞從一個(gè)時(shí)期向另一個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)換的時(shí)間點(diǎn)，稱為限制點(diǎn)。常見的限制點(diǎn)有G1／S、G2／M和紡錘體裝配限制點(diǎn)。惡性腫瘤的生物學(xué)特性之一就是使這些限制點(diǎn)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞的失控性增殖［3］。紅花多糖能阻滯肝癌SMMC-7721細(xì)胞在G2／M期［4］，白花蛇舌草能阻滯結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞在G1／S期［5］。細(xì)胞周期的調(diào)控可分為外源性和內(nèi)源性途徑進(jìn)行，內(nèi)源性途徑主要是通過(guò)細(xì)胞周期素（Cyclins）、細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDKs）、細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子（CKIs）的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)［6］。CDKs與不同的Cyclins結(jié)合形成二聚體后驅(qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入不同的時(shí)期，其中CDK2、CDK4能結(jié)合Cyclin D1，控制細(xì)胞G1／S期的進(jìn)展。研究［7］表明許多腫瘤的CDKs和Cyclins常過(guò)度表達(dá)，從而導(dǎo)致其細(xì)胞周期的異?；钴S。CKIs參與細(xì)胞周期限制點(diǎn)的負(fù)調(diào)控，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，這些小分子蛋白家族為細(xì)胞周期抑制蛋白，包括p16、p53、p27、pRB［8］，其中p16基因位于人類的第9號(hào)染色體短臂2區(qū)1帶（9p21），能抑制CDK4的活性，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，在許多惡性腫瘤中存在純合性缺失［9－10］。

4.2 我們前期研究通過(guò)colony formation實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ECSB能顯著抑制SW620細(xì)胞的增殖，并且是通過(guò)下降Cyclin D1和CDK4的表達(dá)所介導(dǎo)的，但對(duì)p16的影響不明確。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)SW620細(xì)胞在ECSB干預(yù)24 h后，其p16的表達(dá)呈劑量依賴性的上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)在另外一株結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8中也得到相同結(jié)果。150 μg／mL ECSB能下調(diào)HCT-8細(xì)胞的Cyclin D1、CDK4、CDK2，提示ECSB可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)基因起到抑制細(xì)胞增殖的作用。

4.3 ECSB能顯著下調(diào)SW620細(xì)胞的PCNA表達(dá)，并呈劑量依賴性，證明了ECSB能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

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R285.5

A

1000-338X（2017）01-0024-02

2016-10-05

福建省自然科學(xué)基金資助課題（2015J01687）；福建省衛(wèi)生廳青年科研項(xiàng)目資助課題（2014-2-29）；

張鈴（1986—），女，理學(xué)碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥抗腫瘤的機(jī)制研究。

彭軍（1969—），男，教授。E－mail：pjunlab@hotmail.com