馬利，吳巖斌，張超，吳建國，易駿，鄭承劍，吳錦忠（.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州50；.福建教育學(xué)院理科部，福建福州5000；.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海004）

金線蓮乙醇提取物及不同極性部分的體外抗氧化活性作用

馬利1，吳巖斌1，張超1，吳建國1，易駿2，鄭承劍3，吳錦忠1
（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建教育學(xué)院理科部，福建福州350001；3.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200433）

目的研究金線蓮乙醇提取物及其不同極性部位的體外抗氧化活性作用。方法用80%乙醇制備金線蓮乙醇總提取物（CE），以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取CE得到石油醚部位（PEF）、乙酸乙酯部位（EAF）、正丁醇部位（BF）、水部位（AF），用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、羥基自由基清除法測定。結(jié)果金線蓮乙醇提取物及其不同極性部位對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基有不同程度的清除作用，其中乙酸乙酯部位的清除能力最強。結(jié)論金線蓮乙醇提取物及其不同極性部位具有一定的抗氧化和清除自由基的作用。

金線蓮；乙醇提取物；極性部位；抗氧化

金線蓮來源于蘭科開唇蘭屬植物花葉開唇蘭Anoectochilus roxburghii的新鮮或干燥全草，具有清熱涼血、祛風利濕的功效［1］。金線蓮在福建、臺灣和東南亞地區(qū)被視為珍稀名貴藥材，常作為滋補強壯品。近年來國內(nèi)外學(xué)者對金線蓮的化學(xué)成分和藥理作用進行了較多研究，發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分主要為黃酮類、多糖類、內(nèi)酯類成分［2-4］，具有降血糖、保肝、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性［5-9］，臨床用于治療手足口病、高尿酸血癥、肝炎等［10-12］。隨著對金線蓮生物活性研究的深入，其藥用價值得到不斷體現(xiàn)。目前，已有金線蓮乙醇提取物體外抗氧化的報道，但是對其體外抗氧化的活性部位研究的報道較少。我們采用DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羥基自由基清除能力體外抗氧化模型，進行金線蓮抗氧化活性部位的篩選，為研究其抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑金線蓮由儒蘭（福建）生物科技有限公司提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪副教授鑒定為蘭科植物花葉開唇蘭Anoectochilus roxburghii的全草，標本存放在福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院。

ABTS試劑（美國Sigma公司）；DPPH（日本和光純藥株式會社）；BHT（海華藍生物科技有限公司，批號：26973）；甲醇（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）；磷酸二氫鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；磷酸氫二鈉（上海聯(lián)試化工試劑有限公司）；過硫酸鉀（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；硫酸亞鐵（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水楊酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；過氧化氫（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）；水為蒸餾水。

1.2 儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；DLSB-5／20低溫冷卻液循環(huán)泵、HH-S恒溫水浴鍋（鄭州長城科技工貿(mào)有限公司）；CP225D十萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；TECAN Infinite200 PRO多功能酶標儀（帝肯（上海）貿(mào)易有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 樣品提取與制備稱取100 g金線蓮粉末，用15倍量80%乙醇回流提取1 h，過濾，濾渣同法提取2次，合并3次濾液，減壓濃縮，即得金線蓮總提取物（CE）。將金線蓮總提物，加入一定量蒸餾水溶解，混勻，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，收集石油醚、乙酸乙酯、正丁醇不同極性部位萃取液，分別減壓濃縮，得到PEF、EAF、BF，萃取后剩余部分濃縮后得到AF。

2.2 抗氧化活性的測定

2.2.1 清除DPPH自由基分別取2 mL不同濃度0.25～2 mg／mL的金線蓮總提取及不同極性部位供試品溶液，加入0.2mM DPPH甲醇溶液2 mL，避光反應(yīng)30 min，以2 mL不同濃度的BHT為陽性對照，空白對照用80%甲醇代替樣品溶液，在517 nm波長處測吸光度值。

DPPH自由基清除活力＝（1－A1／A0）×100%

式中A0為空白對照的吸光度，A1為供試品的吸光度。

2.2.2 清除ABTS自由基取7 mM的ABTS與2.45 mM過硫酸鉀等體積混合，23℃暗處反應(yīng)12～16 h，得到ABTS.＋。用蒸餾水稀釋ABTS.＋溶液使其在734 nm下的吸光度值在0.7±0.02。取ABTS.＋溶液（吸光度在0.7±0.02）3.9 mL分別加入0.1 mL不同濃度的BHT作為陽性對照，0.1 mL 80%甲醇溶解0.25～3 mg／mL的金線蓮總提取物及其不同極性部位供試品溶液，空白對照用80%甲醇代替樣品溶液搖勻，23℃放置6 min，在734 nm波長處測吸光度。

ABTS自由基清除率＝（1－A1／A0）×100%

式中A0為空白對照的吸光度，A1為供試品的吸光度。

2.2.3 羥自由基清除能力分別取1 mL不同濃度1～3 mg／mL的金線蓮總提取物及不同極性部位供試品溶液依次加入1.5 mM硫酸亞鐵1 mL、20 mM水楊酸鈉0.3 mL、6 mM過氧化氫0.7 mL，搖勻，37℃水浴下反應(yīng)30 min，以抗壞血酸作為陽性對照，以80%甲醇代替樣品溶液作為空白對照，用水代替過氧化氫溶液作為樣品對照，在510 nm波長處測定吸光度值。

羥基自由基清除率＝（1－A1／A0）×100%

式中A0為空白對照的吸光度，A1為供試品的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 清除DPPH自由基作用金線蓮80%乙醇提取物及各不同極性部位對DPPH自由基均有一定的清除作用，在試驗濃度范圍內(nèi)呈明顯量效關(guān)系，其對DPPH自由基的清除能力大小依次為BHT＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞總提取物＞水部位，結(jié)果見圖1。

圖1 金線蓮乙醇提取物及不同極性部位對DPPH自由基的清除作用

在相同質(zhì)量濃度下，EAF部位清除DPPH自由基活性最強，在2 mg／mL時EAF部位對DPPH自由基的清除率達到94.11%；AF部位對DPPH自由基的清除能力相對較低，在2 mg／mL時，其對DPPH自由基的清除率為24.99%。

3.2 清除ABTS自由基作用金線蓮80%乙醇提取物及各不同極性部位對ABTS自由基均有一定的清除作用，在試驗濃度范圍內(nèi)呈明顯量效關(guān)系，其清除能力大小依次為BHT＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞總提取物＞水部位，結(jié)果見圖2。

圖2 金線蓮乙醇提取物及不同極性部位對ABTS自由基清除作用

相同質(zhì)量濃度下，EAF部位對ABTS自由基的清除作用最強，3 mg／mL時最大清除率達57.54%；其它部位對ABTS自由基的清除率相對較低，均未超過30%。

3.3 清除羥自由基作用除水部位外，金線蓮80%乙醇提取物及各不同極性部位對ABTS自由基均有一定的清除作用，在試驗濃度范圍內(nèi)呈明顯量效關(guān)系，其清除能力大小依次為BHT＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞總提取物＞水部位，結(jié)果見圖3。

圖3 金線蓮乙醇提取物及不同極性部位對·OH自由基的清除作用

在3 mg／mL時，乙酸乙酯部位對羥基自由基的清除率達到60.17%，其余部位對羥基自由基的清除率相對較低，均未超過50%；石油醚部位部位在試驗濃度范圍內(nèi)對羥基自由基幾乎沒有什么清除作用。

4 討論

金線蓮乙醇提取物體外抗氧化試驗表明：金線蓮80%醇提取物及其石油醚部位酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位均有抗氧化活性，且不同極性部位的抗氧化活性差異較大。此外，相同極性部位在不同的自由基清除模型中，其清除能力呈不同結(jié)果。在DPPH自由基清除模型中，抗氧化活性強弱順序為：乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞80%醇提物＞水部位；在ABTS自由基清除模型中，抗氧化活性強弱順序為：乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞80%醇提物＞水部位；在羥基自由基清除模型中，抗氧化活性強弱順序為：乙酸乙酯部位＞80%醇提物＞水部位＞正丁醇部位＞石油醚部位。這可能與金線蓮提取物的不同極性部位中所含抗氧化活性成分的種類和結(jié)構(gòu)有關(guān)，因而在不同的抗氧化體系中，金線蓮提取物的不同極性部位的抗氧化作用不同。

金線蓮80%提取物乙酸乙酯萃取部位相對于其它極性部位表現(xiàn)出較強的清除自由基能力，可以作為金線蓮抗氧化活性研究的主要極性部位進行深入研究，并進一步分離其中的抗氧化活性成分。

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R285.5

B

1000-338X（2017）01-0013-03

2016-10-25

國家自然科學(xué)基金資助課題（81603230），福州市科學(xué)技術(shù)局市校合作項目（2014-G-61），福建中醫(yī)藥大學(xué)校管重點學(xué)科專項（X2014138-學(xué)科）

馬利（1991—），女，2015級生藥學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事中藥活性成分及品質(zhì)評價研究。

吳錦忠（1965—），男，教授。E-mail：jinzhongfj@126.com