馮金秋 范愛琴 劉偉 張敏佳 周雅琳 劉坦 許雅君

近年來，我國霧霾污染加重。2013年1月，我國出現(xiàn)了持續(xù)大規(guī)模的霧霾天氣，覆蓋范圍涉及了17個(gè)省市自治區(qū)，約占國土面積的1/4[1]。2014年2月，我國中東部發(fā)生的霧霾污染影響面積達(dá)143萬平方公里，約占全部國土面積的1/7[2]。2015年全年，我國爆發(fā)了高達(dá)11次大范圍、持續(xù)性霧霾污染，在某些地區(qū)PM2.5峰值濃度甚至超過1000微克/立方米[3]，極大地影響了人們的生活與健康。

目前已經(jīng)有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，孕期一定劑量的PM2.5暴露會(huì)增加出生缺陷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Agay-Shay等[4]的隊(duì)列研究結(jié)果表明，PM2.5與嬰兒孤立性動(dòng)脈導(dǎo)管未閉有關(guān)。苑曉燕[5]研究結(jié)果顯示，PM2.5有體外胚胎發(fā)育毒性。但有關(guān)PM2.5發(fā)育毒性的機(jī)制研究卻非常少，有效干預(yù)措施的研究更是寥寥無幾。

大量研究表明，PM2.5主要毒性機(jī)制之一涉及其進(jìn)入機(jī)體后對(duì)組織細(xì)胞的氧化損傷作用。PM2.5除自身帶有活性氧(Reactive oxygen species，ROS)成分外[6-7]，還能刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS和活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)物質(zhì)[6]，因而可使機(jī)體內(nèi)氧化損傷加重。另一方面，PM2.5暴露可引起超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性降低[8]，從而使細(xì)胞內(nèi)的ROS或RNS含量增加。推測，造成母體ROS或RNS含量的增加都可能是PM2.5發(fā)育毒性的機(jī)制之一，那么安全劑量的抗氧化活性物質(zhì)可能對(duì)于PM2.5的發(fā)育毒性具有一定的拮抗作用。

槲皮素是廣泛存在于人類天然食物中的一類多酚類植物化學(xué)物，具有較強(qiáng)的自由基清除功能[9]，對(duì)超氧陰離子有直接或間接的清除作用，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞免受各種不良因素的損傷，發(fā)揮其抗炎、抗纖維化、調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗氧化等作用[10-11]。同時(shí)，它相對(duì)安全無毒，1982年，Willhite[12]就曾報(bào)道大鼠整個(gè)孕期服用2～2000 mg/kg槲皮素對(duì)胎兒均沒有明確的致畸作用，提示其用于孕期的安全性。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)PM2.5的胚胎發(fā)育毒性并探究槲皮素對(duì)PM2.5發(fā)育毒性的拮抗作用，同時(shí)設(shè)置抗氧化活性被廣泛認(rèn)可的VC對(duì)照組，以期為有效地預(yù)防和控制PM2.5對(duì)人類的發(fā)育毒性提供科學(xué)依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

1.實(shí)驗(yàn)材料：槲皮素(購自Sigma 公司，純度≥95%)。

PM2.5采集和制備：采用TH-150C型號(hào)智能中流量(TSP)采樣器(天虹智能儀器表廠，武漢)進(jìn)行PM2.5采集，采樣時(shí)間為2014年11月15日—2015年3月15日，采樣地點(diǎn)位于北京市海淀區(qū)學(xué)院橋附近某建筑，采樣高度為15 m(附近無高大建筑物阻擋)，采樣流量設(shè)置為0.1 m3/min，顆粒物采集于石英濾膜上。石英濾膜在采樣前和采樣后分別恒溫干燥24 h，稱重。用滅菌手術(shù)剪將載有顆粒物的石英濾膜剪成3 cm×4 cm大小，加入超純水，水浴超聲震蕩20 min，加冰保持水溫在20 ℃以下，重復(fù)3次，收集洗脫液，并用6層滅菌紗布過濾。真空冷凍干燥后，用無菌PBS配制成不同濃度貯備液，-20 ℃避光保存?？瞻讓?duì)照組的滴注液直接用干凈的濾膜進(jìn)行上述洗脫操作。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：健康成年SPF級(jí)雌性ICR小鼠，體重(30±2)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2012-0001]。動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜照明時(shí)間為12 h:12h。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體重，隨機(jī)分為6組，空白對(duì)照組、PM2.5模型對(duì)照組、槲皮素低(50mg/kg)、中(100mg/kg)、高(200mg/kg)三個(gè)干預(yù)劑量組和VC干預(yù)組(100mg/kg)，每組10只。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食。槲皮素劑量的確定是參考既往中英文文獻(xiàn)中槲皮素在孕鼠中所使用的干預(yù)劑量。

二、方法

1.實(shí)驗(yàn)操作：雌鼠隨機(jī)分組后，每天晚上18:00將雌鼠與健康SPF級(jí)性成熟雄鼠1:1合籠，第2天早上7:00分籠并檢查陰栓，見栓即認(rèn)為受孕，定為孕期第0天( gestational day 0，GD 0)，所有雌鼠均受孕時(shí)停止合籠。已確定懷孕的雌鼠單籠飼養(yǎng)，并飼喂繁殖期飼料，每天觀察孕鼠有無嗜睡、煩躁、行動(dòng)不便、陰道流血等異常情況出現(xiàn)。孕3、6、9、12、15天稱體重，并記錄食物消耗量。

PM2.5染毒：各組孕鼠分別于GD3、GD6、GD9、GD12和GD15上午，在3%異氟烷短效氣體麻醉下進(jìn)行氣管滴注，空白對(duì)照組給予1 ml/kg干凈石英濾膜洗脫液滴注，其余各組按照1 ml/kg的體積滴注PM2.5溶液，染毒劑量為15 mg/kg。

灌胃：孕鼠自GD0～GD17，每日灌胃?？瞻讓?duì)照組和PM2.5模型對(duì)照組給予0.15%羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃，3個(gè)槲皮素干預(yù)組分別給予50、100、200 mg/kg槲皮素灌胃，VC干預(yù)組給予100 mg/kg VC灌胃，槲皮素和VC均以0.15%羧甲基纖維素鈉作為分散系。

孕18天處死所有孕鼠。

2.母鼠血清抗氧化指標(biāo)檢測：孕18天用摘眼球取血法收集孕鼠血液，靜置30 min后離心分離血清，進(jìn)行抗氧化指標(biāo)檢測?？寡趸笜?biāo)包括過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)，所用試劑盒均由碧云天公司生產(chǎn)，貨號(hào)分別為S0051和S0053，所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3.胚胎毒性和骨骼發(fā)育檢測：收集血樣后，頸椎脫臼法處死孕鼠，迅速完整分離子宮后稱量子宮連胎重。稱重后迅速剖開子宮，記錄活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)，稱量活胎及其胎盤重量并測量胎鼠身長和尾長，每窩取半數(shù)活胎放入Bouin's液固定，以備進(jìn)行內(nèi)臟畸形檢查，另外半數(shù)放入95%乙醇中固定，以備進(jìn)行骨骼畸形檢查。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。其中，胚胎毒性部分和肋骨畸形的數(shù)據(jù)用χ2檢驗(yàn)，枕骨骨化情況的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，其他數(shù)據(jù)則采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，方差齊時(shí)利用LSD法進(jìn)行兩兩比較，方差不齊時(shí)采用Tamhane’s T2法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、母鼠血清抗氧化指標(biāo)

PM2.5模型對(duì)照組母鼠血清中的CAT活力顯著低于空白對(duì)照組，VC干預(yù)組和三個(gè)槲皮素干預(yù)組較PM2.5模型對(duì)照組有所改善，其中槲皮素低和中劑量組的CAT活力與PM2.5模型對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組間血清中GSH含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；見表1。

表1 槲皮素對(duì)孕期PM2.5染毒母鼠血清中抗氧化指標(biāo)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與PM2.5模型對(duì)照組比較，#P<0.05

二、胚胎毒性

孕期PM2.5染毒對(duì)胚胎的發(fā)育和存活影響不大，未呈現(xiàn)明顯的胚胎毒性。各組的活胎數(shù)量、吸收胎數(shù)量和死胎數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。與其他組相比，VC干預(yù)組的胚胎毒性最大。

三、胎鼠情況

PM2.5模型對(duì)照組的平均胎鼠體重顯著低于空白對(duì)照組，VC干預(yù)組和三個(gè)槲皮素干預(yù)組較PM2.5模型對(duì)照組平均胎鼠體重有所增加，槲皮素中劑量組與PM2.5模型對(duì)照組的平均胎鼠體重比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PM2.5模型對(duì)照組的胎鼠身長顯著低于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余各組與PM2.5模型對(duì)照組相比，均有不同程度的改善，其中槲皮素中劑量組與PM2.5模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組間胎盤重、胎鼠身長比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；見表3。

表2 槲皮素對(duì)孕期PM2.5染毒母鼠胚胎毒性的影響

表3 槲皮素對(duì)PM2.5染毒孕鼠的胎鼠體重、胎盤重、胎鼠身長、胎鼠尾長的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與PM2.5模型對(duì)照組比較，#P<0.05

四、胎鼠外觀、內(nèi)臟和骨骼發(fā)育情況

各組活胎胎鼠外觀檢查和內(nèi)臟檢查均未發(fā)現(xiàn)明顯畸形。骨骼觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，PM2.5模型對(duì)照組胎鼠14肋骨畸形和枕骨骨化不全的發(fā)生率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組相比，槲皮素三個(gè)干預(yù)組的14肋骨畸形情況得到改善，槲皮素三個(gè)干預(yù)組的枕骨骨化情況也均有明顯的改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，通過比較發(fā)現(xiàn)，VC干預(yù)在一定程度上增加了PM2.5所致后代骨骼畸形的發(fā)生；見表4。

表4 槲皮素對(duì)胎鼠骨骼發(fā)育的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與PM2.5模型對(duì)照組比較，#P<0.05；兩兩比較時(shí)經(jīng)Bonferroni校正(α調(diào)整=0.05/15=0.0033)

討 論

研究表明，大氣中可吸入顆粒物會(huì)對(duì)胎兒的宮內(nèi)發(fā)育造成一定影響。van den Hooven等[13]對(duì)荷蘭7 772名母嬰隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，妊娠后3個(gè)月暴露于PM10和NO2可減少胎兒頭圍。施淼等[14]對(duì)畸形胎兒的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，妊娠1～3個(gè)月PM10暴露濃度越高，胎兒血管畸形的危險(xiǎn)性越高。相對(duì)于PM10，PM2.5由于其比表面積大，易攜帶大量有毒有害物質(zhì)經(jīng)呼吸道進(jìn)入人體肺部深處及血液循環(huán)，被認(rèn)為對(duì)人體產(chǎn)生的危害更大[15-16]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕期以15 mg/kg PM2.5染毒可產(chǎn)生一定的胚胎發(fā)育毒性，表現(xiàn)為胎鼠體重下降和胎鼠身長縮短。三個(gè)槲皮素干預(yù)組的胎鼠體重和胎鼠身長均較模型對(duì)照組有不同程度的增加，提示孕期膳食中補(bǔ)充槲皮素可以在一定程度上改善胚胎的生長發(fā)育，但這一效應(yīng)在本研究劑量下并沒有呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，而是中劑量組的改善效果整體最好，低和高劑量組均稍差，提示槲皮素在改善胚胎發(fā)育狀況存在一個(gè)最佳劑量范圍。此外，PM2.5染毒可導(dǎo)致14肋骨畸形的發(fā)生率增加和枕骨骨化不全程度加重。槲皮素干預(yù)后，14肋骨畸形的發(fā)生率下降和枕骨骨化不全程度得到改善，且與PM2.5模型對(duì)照組相比，三個(gè)槲皮素干預(yù)組的枕骨骨化不全程度的改善。而各組間活胎率、死胎率和吸收胎率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且活胎率均較高，這可能提示在本研究的劑量范圍內(nèi)，雖然PM2.5會(huì)影響胚胎的生長發(fā)育以及具有一定的發(fā)育毒性，但由于機(jī)體具有胎盤屏障等保護(hù)機(jī)制，并不會(huì)造成較多死胎、吸收胎的嚴(yán)重后果。

ROS在PM2.5毒性過程中可能發(fā)揮重要的作用，而機(jī)體為避免受到內(nèi)源性或外源性ROS的損傷，在進(jìn)化過程中形成了一整套代謝的抗氧化系統(tǒng)，主要由酶和抗氧化劑組成，如CAT、SOD、GSH等。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)孕鼠血清中抗氧化指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)，孕期PM2.5染毒可以使母鼠血液中的過氧化氫酶(CAT)活力顯著下降，而一定劑量的槲皮素干預(yù)，逆轉(zhuǎn)了母鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，與之相應(yīng)仔鼠的發(fā)育毒性也在一定程度上得到了抑制，這一結(jié)果提示PM2.5致發(fā)育毒性的機(jī)制之一可能是其引發(fā)的氧化損傷。但另一方面，本研究中只有槲皮素低劑量組和中劑量組的CAT活力顯著提高，而高劑量槲皮素干預(yù)組的抗氧化效果反而不及中低劑量組，說明槲皮素的抗氧化作用在生物體內(nèi)發(fā)揮時(shí)具有適宜的劑量范圍，劑量過高時(shí)反而可能加重氧化損傷。這一點(diǎn)之前已有相關(guān)報(bào)道，如劉爽等[17]的研究發(fā)現(xiàn)乙醇染毒肝細(xì)胞用100 μmol及以上的槲皮素干預(yù)時(shí)，CAT的水平與乙醇模型組反而無差異，而在低于該劑量時(shí)抗氧化效果明顯。姚芳芳等[18]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)槲皮素干預(yù)劑量達(dá)到40 mg/kg和50 mg/kg時(shí)，血清SOD活性下降、MDA含量上升。

VC是公認(rèn)的氧自由基清除劑，本研究選擇它作為陽性對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VC組的母鼠血清中抗氧化指標(biāo)較PM2.5模型對(duì)照組有所改善，說明VC的抗氧化作用得以實(shí)現(xiàn)，但是拮抗PM2.5發(fā)育毒性的效果卻不佳，甚至在一定程度上加重了PM2.5的發(fā)育毒性。分析其原因可能是PM2.5誘導(dǎo)發(fā)育毒性的機(jī)制眾多，氧化損傷只是其中之一。100 mg/kg VC雖然在一定程度上拮抗了部分氧化損傷作用，但尚不足抵消其他原因?qū)е碌陌l(fā)育毒性，甚至由于PM2.5比表面積較大，表面攜帶的成分非常復(fù)雜[19]，包含很多無機(jī)組分和有機(jī)組份，VC本身作為一種還原性較強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，不排除其與PM2.5上的某些特殊成分發(fā)生反應(yīng)，增強(qiáng)該成分的發(fā)育毒性甚至生成具有發(fā)育毒性物質(zhì)的可能，而這些物質(zhì)作用的結(jié)果不足以被VC抗氧化的保護(hù)作用抵消，整體結(jié)果表現(xiàn)為發(fā)育毒性不減反增的情況，但具體機(jī)制還需要待進(jìn)一步探討。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，一定劑量的槲皮素可以拮抗PM2.5的發(fā)育毒性，但存在適宜的劑量范圍，并非劑量越高拮抗效果越好。在槲皮素拮抗PM2.5發(fā)育毒性的機(jī)制中，抗氧化可能發(fā)揮了一定作用，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

1 《2013年空氣污染(霧霾)健康影響監(jiān)測工作方案》解讀.

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