曹羽明 瞿鑫蘭 張銘 左馳 姚燕如 楊寒笑 張元珍

雙酚A(Bisphenol A,BPA)學名2,2-二(4-羥基苯基)丙烷，是近幾年廣受關注的一種環(huán)境內分泌干擾物，其具有弱雌激素活性，可以對人類健康產生復雜的影響，可涉及到全身多個器官，特別是生殖系統(tǒng)。以往對BPA生殖毒性的研究多著眼于其弱雌激素效應[1-3]，對卵泡發(fā)育及卵巢功能影響的報道偏少。近期研究表明，女性卵巢儲備功能下降與血尿BPA濃度相關，BPA可能影響卵泡發(fā)育進而降低卵巢儲備功能[4]。但安全劑量范圍內的BPA對剛進入性成熟期小鼠卵巢儲備功能的影響尚未見報道。本研究旨在探討低劑量BPA亞慢性暴露是否引起雌性小鼠卵巢儲備功能下降，為進一步解讀BPA的卵巢毒性提供理論依據。

對象與方法

一、對象

本課題已通過武漢大學中南醫(yī)院倫理委員會審批。動物實驗的實施及對實驗動物的應用操作已通過武漢大學A3實驗室批準。動物均麻醉后取血并處死，最大程度地減少對動物的傷害。

64只5周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠，體重15～17 g，購買于武漢大學A3實驗室并在此飼養(yǎng)應用。小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為4組，每組16只。

二、方法

1.分組：BPA(分析純，純度≥97%)以玉米油為溶劑，配成5、50、500 μg/ml BPA溶液(BPA低、中、高劑量組)，僅玉米油處理作為溶劑對照組。每天上午8:00時開始小鼠稱重并按10 ml/kg溶液及組別灌胃，連續(xù)處理28 d。實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12 h交替，室內溫度控制在(21±2)℃，濕度控制在50%～60%，食物和水自由攝取。

2.指標觀察：(1)一般體質量。每日仔細觀察各組小鼠飲食、排便、活動及精神狀態(tài)有無異常，每日小鼠稱重并做記錄，以周為單位統(tǒng)計體重增長的組間差異(將小鼠放入燒杯置于電子天平上稱重，待天平穩(wěn)定后迅速讀數(shù)。若有小數(shù)位，則按照“四舍五入”原則修約)。(2)血清激素水平測定。小鼠持續(xù)BPA處理28天后，麻醉后小鼠框內靜脈取血，所取血液樣品于4 ℃靜置3 h，低溫離心機內4 ℃(3000 r/min)離心15 min，用移液槍取上清液，ELISE試劑盒(購于武漢華聯(lián)科生物有限公司)檢測血清AMH及E2激素水平。

3.熒光定量PCR法：檢測卵巢組織中AMHmRNA的表達。卵巢組織取出后投入液氮罐中凍存，各組小鼠處理完畢后將卵巢組織取出，Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度得到可用樣本。設計并合成引物，引物序列見表1。逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，在MX200096孔熒光定量PCR板中，每孔依次加入以下反應體系：cDNA 1 μl、SYBR Rremix Ex TaqTM(2X) 12.5 μl、PCR Primer(R+F) 1 μl、ROX Refence Dye 2(50X) 0.5 μl、dH2O 10 μl,總PCR體系為25 μl。按照下述條件進行擴增：95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。得到各組目的基因與內參基因的Ct值，按2-△△CT法[5]計算待測目的基因表達量。

表1 熒光定量PCR的引物序列

4.免疫組織化學法：檢測卵巢組織AMH蛋白的表達。處死小鼠后快速獲取卵巢并去除周圍脂肪組織，卵巢組織經4%多聚甲醛固定24 h后，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋，間斷均勻切片，應用免疫組化試劑盒染色并鏡檢拍照，分別選擇5個不同視野進行評分。評分標準如下。染色面積:著色細胞<5%為0分；5%～25%為1 分；25%～50%為2分；50%～75%為3分；>75%為4分。染色強度：沒有著色為0分；淡黃色為1分；棕色為2分；深棕色為3分。綜合得分=染色面積得分×染色強度得分。

結 果

一、不同濃度BPA亞慢性暴露對小鼠體質量的影響

各組灌胃期間小鼠精神狀態(tài)佳，飲食、排便及活動均無異常。各組小鼠體重每周體重均呈增長趨勢，BPA低、高劑量組體重增長較緩慢，差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

圖1 不同濃度BPA亞慢性暴露對小鼠體重的影響(周)

組別例數(shù)第1周第2周第3周第4周對照組1616．50±0．6417．98±0．5119．47±0．7220．82±0．72BPA低劑量組1617．09±0．4418．47±0．6119．57±0．4820．30±0．72BPA中劑量組1616．80±0．7118．58±1．0119．76±0．8320．89±0．59BPA高劑量組1616．87±0．5218．64±0．5519．02±0．5620．47±0．77

二、4組血清AMH、E2激素水平的影響

BPA處理組小鼠血清AMH及雌激素(E2)激素水平均低于對照組，BPA低、高劑量組下降顯著，差異有統(tǒng)計學意義，見表3，圖2。

三、4組AMH mRNA表達的影響

BPA處理組卵巢組織中AMH mRNA表達低于對照組，BPA低、高劑量組下降顯著，差異有統(tǒng)計學意義，見表3、圖3。

四、4組AMH蛋白表達的影響

BPA處理組小鼠卵巢組織中AMH蛋白表達與其mRNA表達趨勢一致，AMH蛋白表達顯著低于對照組，BPA低、高劑量組下降顯著，差異有統(tǒng)計學意義，見表3、圖4。AMH主要表達于卵泡腔內，極少表達于卵泡間質(圖5)。

表3 4組AMH激素水平、雌激素、AMHmRNA及蛋白的表達

圖2 4組血清激素水平比較 A.血清AMH; B.血清E2濃度。*P<0.05

圖3 4組卵巢AMH mRNA表達比較 *P<0.05

圖4 4組AMH蛋白表達比較 與對照組比較，*P<0.05

隨著塑料制品的廣泛使用，人群BPA暴露非常普遍。流行病學表明，超過90%的個體尿液中可以檢測到BPA,廣泛暴露于BPA對雌性生殖系統(tǒng)存在一定的影響[6-7]。美國環(huán)境保護署1988年首次確定50 μg/(kg·d)為人群BPA的安全參考劑量[8]，到目前依然沿用此標準。然而，安全劑量是否對所有組織器官均無毒害作用值得深思。目前文獻報道，BPA在相關實驗中的應用劑量相差較大，各研究階段在種屬、劑量等方面均不同，導致研究結果也存在一定的差異[9-12]。為了能夠更加準確地反映BPA對雌性卵巢儲備的劑量效應，選擇美國環(huán)境保護署規(guī)定的安全劑量，針對性探索低劑量BPA亞慢性暴露對雌性小鼠卵巢儲備功能的影響，使研究結果更有參考價值。AMH是轉化生長因子B(TGF-B)超家族成員，由卵巢竇前卵泡和小竇狀卵泡的顆粒細胞分泌，在卵巢顆粒細胞上表達，是卵泡生長發(fā)育的重要調節(jié)因子，其參與生理性卵泡形成過程中重要的始基卵泡募集和優(yōu)勢卵泡募集，目前認為卵巢顆粒細胞是人類AMH的唯一來源。AMH的濃度水平在整個月經周期中無明顯變化，所以可以直接用來反映卵巢的功能狀態(tài)[13]。Meczekalski等[14]研究明確指出，AMH可以作為衡量晚孕生育能力及輔助生殖妊娠結局的指標，其可以準確的評價生殖壽命。Monniaux等[15]研究證實，血清AMH激素水平可以作為評價卵巢儲備功能的可靠指標，不只可應用于人群，也可以用于其他物種。

本研究選擇剛剛進入性成熟期的小鼠，其卵巢處在產生雌性生殖作用的早期，結果顯示，BPA可以引起卵巢儲備功能下降，不僅表現(xiàn)在血清AMH及E2激素水平下降，基因及蛋白表達也出現(xiàn)明顯下調，由此證實BPA對卵巢儲備功能的影響存在非單調劑量效應作用，其呈現(xiàn)出明顯的“U”型效應關系，此結果與前期對BPA生殖效應的研究保持一致[16-17]。雙酚A在整個劑量范圍內存在不同的作用機制，在不同劑量范圍內有不同的作用機制占主導地位，在較低劑量時可能通過激素受體介導或拮抗產生特殊的生物效應，而劑量升高至一定程度時，雙酚A與激素受體的作用達到飽和，與受體相關的響應逐漸被抑制，至高劑量時則表現(xiàn)出急性毒性機制。早在2004年，Zala等[18]已明確指出，在內分泌干擾物的毒理研究中這種非單調效應關系已成規(guī)律而非特例?；A雌激素低水平是卵巢反應性下降的預測指標，BPA能使血清雌激素水平降低，進而引起卵巢低反應。持續(xù)卵巢低反應加劇雌、孕激素水平低下，反饋性促使FSH再升高，不能刺激LH峰的出現(xiàn)，導致顆粒細胞萎縮、卵泡體積變小，從而阻斷卵泡的發(fā)育過程。

在哺乳動物的發(fā)育過程中AMH具有性別特異性和時間依賴性，胚胎期AMH表達缺陷可導致兩性畸形的發(fā)生。其在卵泡發(fā)育的啟動和選擇性生長中也起到重要作用，AMH在卵泡細胞中高表達，并伴隨生殖細胞的消亡而表達降低，閉鎖卵泡中AMH呈低表達狀態(tài)，因而AMH基因低表達提示原始卵泡發(fā)育為生長卵泡的過程受到影響。BPA慢性暴露后小鼠卵巢組織AMH的表達下降，說明BPA可以加速小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡過程，促使多數(shù)卵泡發(fā)生閉鎖。研究證明，BPA可影響顆粒細胞激素分泌及減數(shù)分裂過程，加速卵巢顆粒細胞的凋亡，進而引起發(fā)育卵泡的閉鎖[19-20]。Durlinger等[21]研究表明，AMH缺失型小鼠比同窩出生的野生型小鼠多了近3倍的小卵泡，卵巢內的始基卵泡隨著小鼠的生長而耗竭。在人卵巢組織中，出生時約有200萬個卵泡，到青春期時卵泡數(shù)量約30萬個左右，而在婦女生育期內可正常發(fā)育并完成排卵的卵泡只有400～500個，因此，卵巢中只有一小部分卵泡可以發(fā)育成熟并完成排卵，而大多數(shù)卵泡均退化閉鎖，以致卵泡細胞缺乏再生能力，最終導致生育功能減退。BPA可能通過干預生殖細胞的減數(shù)分裂過程而加速顆粒細胞凋亡及卵泡的閉鎖，使AMH呈現(xiàn)低表達狀態(tài)。而AMH缺乏，始基卵泡也將以更快的速率被募集,導致始基卵泡池提前成熟耗竭，使生殖壽命縮短。

綜上所述，亞慢性暴露于低劑量雙酚A即可導致成年小鼠卵巢儲備功能下降。但BPA對小竇狀卵泡的數(shù)量及各級卵泡構成等影響還有待進一步研究。

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