韋小妮 唐寧 王文丹

目前，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)行G顯帶染色體核型分析依舊是產(chǎn)前診斷染色體檢查的重要手段[1-2]。該技術(shù)由于培養(yǎng)條件、羊水質(zhì)量、個(gè)體差異，操作者技術(shù)水平等諸多因素的影響，目前仍存在操作繁瑣耗時(shí)、易污染、分裂相少等問題[3-4]。此外，隨著染色體芯片技術(shù)在超聲異常但核型正常胎兒的檢測(cè)應(yīng)用逐步顯現(xiàn)[5]，因此，對(duì)現(xiàn)有傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)及核型分析技術(shù)進(jìn)行改良優(yōu)化，提高產(chǎn)前診斷效率，并為染色體芯片檢測(cè)提供優(yōu)質(zhì)實(shí)驗(yàn)材料就顯得極為必要。為此，本研究在傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞培養(yǎng)及收獲方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行不斷改良優(yōu)化，取得了較為滿意的結(jié)果，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：收集2016年3—4月在本院接受產(chǎn)前診斷羊水穿刺、細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析的孕婦780例，孕周16～22+6周。產(chǎn)前診斷的指征包括產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)、高齡孕婦、不良生育史、B超發(fā)現(xiàn)異?；蚍驄D之一為染色體平衡易位攜帶者等。

2.羊水標(biāo)本的采集：根據(jù)知情同意的原則，孕婦排空膀胱，輕輕晃動(dòng)腹部后，在B超介導(dǎo)下用一次性羊水穿刺針經(jīng)腹穿刺抽取羊水16 ml，分裝于兩支14 ml無菌離心管(BD352001管)中，8 ml/支。

3.羊水細(xì)胞接種培養(yǎng)：將送檢的羊水細(xì)胞離心6 min(1800 rpm/min),棄去上清液，每管留1.5 ml羊水及其沉淀細(xì)胞，使用無菌吸管輕輕混勻，接種，傳統(tǒng)方法接種為將所有的懸液均接種于盛有3.5 ml羊水培養(yǎng)基(廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司)的培養(yǎng)瓶(BD公司的3531008培養(yǎng)瓶)中，丟棄羊水管，混勻，置37.0 ℃ 5.0% CO2培養(yǎng)箱中半開放式培養(yǎng)，而改良式方法較傳統(tǒng)方法不同之處在于僅取1 ml懸液進(jìn)行接種，置37.0 ℃ 5.0% CO2培養(yǎng)箱中半開放式培養(yǎng)，盛有剩余的0.5 ml羊水沉淀細(xì)胞的無菌離心管留存于冷藏冰箱中待備用。

4.細(xì)胞培養(yǎng)、換液：培養(yǎng)至第6天時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，有貼壁細(xì)胞生長時(shí)則進(jìn)行換液，利用手腕力輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，棄去上清液，加入新鮮的羊水培養(yǎng)基3.5 ml，繼續(xù)培養(yǎng)，若未見貼壁細(xì)胞生長，尋找未生長的原因，若為污染所致則直接丟棄，并與臨床聯(lián)系，未發(fā)現(xiàn)具體原因的則繼續(xù)原瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)至14天后仍未見細(xì)胞生長則及時(shí)與臨床聯(lián)系，視為培養(yǎng)失敗。

5.羊水細(xì)胞的收獲、制備

(1)傳統(tǒng)方法：于換液后的第2天取出，觀察細(xì)胞生長的情況，當(dāng)細(xì)胞克隆≥3個(gè)大克隆(4倍鏡下>2/3視野)或不少于6個(gè)中克隆(4倍鏡下介于2/3視野和1/3視野)，且較多(總共≥30個(gè))圓形透亮的有絲分裂細(xì)胞時(shí)，加入秋水仙堿(20 μg/ml，50 μl)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，即可收獲。在室溫條件下，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，生理鹽水洗滌一次后，使用刮子輕輕刮取貼壁細(xì)胞使其脫落，轉(zhuǎn)移至離心管中離心6 min(1800 rpm/min),棄去上清液，加 4 ml 0.075M氯化鉀溶液，使用吸管吹打混勻，37 ℃水浴箱中低滲30 min,加入新鮮配制的固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)0.5 ml，吸管吹打混勻，離心6 min(1800 rpm/min),棄去上清液，加入5 ml固定液固定，離心，重復(fù)一次，調(diào)制懸液，干片法制片，烤片，胰酶法G顯帶。按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 1995)標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析。

(2)改良方法：區(qū)別于傳統(tǒng)方法，①倒棄上清液，無須留存上清液，無須生理鹽水洗滌，無需使用刮子進(jìn)行刮取，直接加入0.25% EDTA-胰酶(上海源培)溶液進(jìn)行細(xì)胞消化；②消化完成后直接轉(zhuǎn)移至離心管中，無須離心取沉淀，而是直接加入4 ml 0.075M氯化鉀溶液終止，輕輕水平混勻，37 ℃溫箱中進(jìn)行低滲，低滲時(shí)間較傳統(tǒng)方法不同，為12 min；③使用漩渦混勻器震蕩混勻取代吸管吹打混勻。

6.觀察指標(biāo)：隨機(jī)抽取留存在冷藏冰箱7～15 d后的羊水懸液110例(7天后的為15例，8天后的20例，9天后的為20例，13天后的為20例，14天后的為15例，15天后的為20例)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，觀察其在培養(yǎng)后第6天的細(xì)胞克隆數(shù)。

結(jié)果

傳統(tǒng)及改良方法的細(xì)胞培養(yǎng)成率均達(dá)99.9%，兩種方法細(xì)胞培養(yǎng)失敗的標(biāo)本為同一患者的標(biāo)本，所得核型見圖1、圖2。在第7、8、9天，兩種方法可收獲數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；收獲到≥20個(gè)可供分析的分裂相數(shù)，兩種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在同批次收獲10個(gè)標(biāo)本耗時(shí)中，改良法較傳統(tǒng)法平均省時(shí)30 min；見表1。

表1 兩種方法情況

注：兩種方法比較，*c2=90.52，P<0.05

圖1 改良式法所得核型

圖2 傳統(tǒng)法所得核型

第14天未能收獲的1例標(biāo)本(在第18天才能收獲)，為同一患者的標(biāo)本；采用留存的羊水懸液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，其在培養(yǎng)后第6天的細(xì)胞克隆數(shù)均不少于4個(gè)，多的甚至可達(dá)到12個(gè)。

討論

羊水細(xì)胞培養(yǎng)及核型分析是產(chǎn)前診斷的重要技術(shù)手段，是一項(xiàng)綜合性很強(qiáng)的技術(shù)。高質(zhì)量的羊水細(xì)胞培養(yǎng)、收獲是進(jìn)行羊水染色體核型分析診斷的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞培養(yǎng)是將羊水離心后將所有的沉淀細(xì)胞均接種于培養(yǎng)瓶中，加秋水仙素培養(yǎng)后將貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中用刮子將其慢慢刮落下來，然后用吸管轉(zhuǎn)移至離心管里進(jìn)行離心、低滲、預(yù)固定和固定等，細(xì)胞培養(yǎng)周期長，容易發(fā)生污，一旦在生長過程中發(fā)生污染，則很難進(jìn)行補(bǔ)救。此外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程極其繁瑣，每一個(gè)大環(huán)節(jié)中包括較多的小細(xì)節(jié)，例如收獲則包括加入秋水仙堿，脫落貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)移脫落細(xì)胞至離心管中等，一旦在一個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中出現(xiàn)操作不佳或錯(cuò)誤均可導(dǎo)致收獲不成功，或不準(zhǔn)確，無法給患者提供一個(gè)可靠的結(jié)果。為此，國內(nèi)有人提出倒出一半培養(yǎng)液，并加入新鮮培養(yǎng)液的等方法來提高成功率[6]，也有產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室提出利用舊培養(yǎng)基4 ℃冰箱保存2～12 d后分離其內(nèi)細(xì)胞傳代培養(yǎng)等優(yōu)化技術(shù)來提高細(xì)胞培養(yǎng)的成功率[7]，該法實(shí)施的前提是在培養(yǎng)的過程中有細(xì)胞克隆生長，但是該法中實(shí)驗(yàn)室利用無菌耗材對(duì)舊培養(yǎng)基進(jìn)行保存，增加了實(shí)驗(yàn)室的支出，因方法的局限性，它無法為細(xì)胞在培養(yǎng)過程中受到污染導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的標(biāo)本提供補(bǔ)救措施，故一旦出現(xiàn)此情況只能重新取材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但是產(chǎn)前診斷的標(biāo)本來之不易，其取材需要耗費(fèi)人力、物力，尤為重要的是還存在流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。因此，應(yīng)該最大程度避免對(duì)孕婦進(jìn)行再重新取材檢查，基于以上原因，本研究在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)接種和收獲過程進(jìn)行改良。

改良法相對(duì)于傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn)如下。(1)留存有原始標(biāo)本。改良式方法在保障細(xì)胞培養(yǎng)成功率(成功率為99.9%)、不延遲收獲周期和不額外浪費(fèi)試劑、耗材、人力的前提下，保存了部分原始標(biāo)本，這些標(biāo)本可用于：重新進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，本研究可得知羊水細(xì)胞置于冷藏冰箱中保存7～15 d，其細(xì)胞活性未見明顯降低，取出，復(fù)溫，也能成功培養(yǎng)出不少量的細(xì)胞；有利于真假嵌合體的分析，當(dāng)兩線結(jié)果出現(xiàn)偏差時(shí)有利于溯源；當(dāng)有需要進(jìn)行染色體微陣列分析( chromosomal microarray analysis，CMA)等進(jìn)一步檢查時(shí)提供原始材料，無需重新再取材，避免浪費(fèi)，規(guī)避了風(fēng)險(xiǎn)。(2)優(yōu)化了脫落貼壁細(xì)胞的過程。傳統(tǒng)方法中，人為使用刮子將貼壁的羊水細(xì)胞刮落，耗時(shí)長，且要求力度適中，慢慢地刮取，若力度不合適則不易將細(xì)胞脫落下來或脫落下來的細(xì)胞不易分散，最終導(dǎo)致收獲到的適用分裂相少，而改良法中，采用0.25% EDTA-胰酶溶液脫落細(xì)胞，無需人為用力，無需特定的技巧，只需在溫箱中溫育6 min，貼壁細(xì)胞即可完全自瓶中脫落下來。(3)收獲染色體的過程中，傳統(tǒng)方法使用吸管吹打，吸管錯(cuò)位吹打，則易發(fā)生交叉污染，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，而在改良法中采用漩渦混勻器進(jìn)行混勻，無需使用吸管，其混勻所需時(shí)間較使用吸管時(shí)減少，節(jié)約了時(shí)間，過程中大大地減少了交叉污染的可能。(4)改良方法的操作步驟較傳統(tǒng)方法少，如脫落后的細(xì)胞可直接進(jìn)行低滲，中途減少了一次離心的過程，又縮短了工作時(shí)間，故批次10個(gè)標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)時(shí)間平均縮短了30 min，同時(shí)提高了收獲效率，如圖1和圖2所示，改良方法其所得到的核型較之傳統(tǒng)法的多、好，能夠用于發(fā)放報(bào)告的成功率達(dá)到100%。

此外，本研究對(duì)于培養(yǎng)失敗的標(biāo)本和未能在14 d收獲的標(biāo)本進(jìn)行了原因分析及追蹤。(1)培養(yǎng)失敗的標(biāo)本：該標(biāo)本的羊水性狀未見明顯異常，羊水沉淀量不少，過程中培養(yǎng)基未見明顯渾濁跡象，培養(yǎng)至第14天，未見貼壁細(xì)胞生長，取1 ml培養(yǎng)瓶中的液體進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，未見異常，懷疑可能為該孕婦本身的特異性引起的不明原因培養(yǎng)失敗，該孕婦重新取臍帶血進(jìn)行培養(yǎng)行核型分析，核型未見明顯異常。(2)未能在14天收獲的標(biāo)本：該羊水性狀異常，為褐色，離心后可見灰白色沉淀，故導(dǎo)致其羊水細(xì)胞生長緩慢，至第14天未能收獲，但是經(jīng)過原瓶再分布及加液處理，在第18天可收獲，核型結(jié)果顯示未見明顯異常。由此得出，該標(biāo)本是由于孕婦本身羊水異常導(dǎo)致其生長緩慢，收獲的時(shí)間拖后，但是只要實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行有目的的處理，其亦可得到足夠多的核型進(jìn)行分析。

綜上所述，改良式羊水細(xì)胞培養(yǎng)及收獲的方法在產(chǎn)前診斷染色體檢查中的應(yīng)用可在最大程度上避免孕婦再次羊膜腔穿刺及風(fēng)險(xiǎn)較高的臍帶血穿刺，進(jìn)一步確保了一次性穿刺可達(dá)到產(chǎn)前診斷染色體檢查成功的效果，而且操作簡單，耗時(shí)少，具有廣泛的推廣應(yīng)用前景。

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