許澤輝 崖嬌練 羅世強 李哲濤 黃際衛(wèi) 唐寧

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing, NIPT)技術(shù)是一項胎兒染色體非整倍體如21三體(Trisomy 21, T21)、18三體(Trisomy, T18)、13三體(Trisomy, T13)的產(chǎn)前篩查新技術(shù)，準(zhǔn)確率達到99%以上，在產(chǎn)前篩查中有著良好應(yīng)用前景。2014年，國家衛(wèi)計委批準(zhǔn)第一批NIPT試點，標(biāo)志著NIPT將逐步進入臨床應(yīng)用。同時多家公司的NIPT配套試劑和儀器通過CFDA批準(zhǔn)，迅速進入各NIPT試點。為了保證檢測質(zhì)量，衛(wèi)生部臨檢中心隨之出臺了全國外周血胎兒染色體非整倍體(T21、T18和T13)高通量測序檢測室間質(zhì)量評價，并于2015年正式開展。此前，NIPT樣本一直在第三方檢測機構(gòu)檢測，如今整個NIPT流程將在醫(yī)院實驗室完成。本地化過程中是否能保持高度一致的檢測水平，能否高標(biāo)準(zhǔn)通過室間質(zhì)量評價，成為各試點迫切關(guān)心的一個問題。本實驗室前期進行的一批367例NIPT篩查實驗，在隨后的跟蹤隨訪中證實了NIPT結(jié)果的準(zhǔn)確性，與國際上大多數(shù)研究結(jié)果比較一致。隨后，本實驗室引進基于NextSeq CN500基因測序儀的NIPT檢測平臺。針對NIPT在醫(yī)院PCR實驗室資質(zhì)和產(chǎn)前診斷母嬰保健技術(shù)準(zhǔn)入實驗室環(huán)境下的檢測能力報道不多見，主要集中在如何改善NIPT檢測的準(zhǔn)確性。國外研究也較少，原因包括倫理及宗教信仰等因素，即使發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，可能并不能終止妊娠。為了進一步了解NIPT結(jié)果的重復(fù)性，本實驗室對已知結(jié)果的樣本進行重復(fù)實驗，探究NIPT檢測在重復(fù)性方面的表現(xiàn)。

對象與方法

一、對象

實驗材料為2014年7月份由柳州市婦幼保健院婦產(chǎn)圍生科采集凍存的孕婦外周血漿樣本。采集規(guī)則：根據(jù)國內(nèi)外的NIPT臨床指導(dǎo)意見，從標(biāo)本采集開始排除不適用NIPT的樣本。

二、方法

1.試劑與器材：血漿游離DNA提取試劑盒，Cat:R0011;高通量測序文庫構(gòu)建DNA純化試劑盒(磁珠法)，Cat:R0022;NestSeq CN500 Buffer Cartridge, REF:15054656;High Output Reagent Cartridge,REF:15053214;High Output Flow Cell Cartridge,REF:15043755，杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司生產(chǎn)。SYBR Green PCR Master Mix，Cat:10687-581,ABI公司。DNA定量分析儀(Qubit?2.0 Fluorometer)，Cat:4376600, Life technology公司生產(chǎn)。CFX96?Real Time PCR system,Bio-Rad T100 PCR儀，伯樂公司。NextSeq CN500高通量測序儀及貝比安?數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

2.實驗方法：將367例NIPT前瞻性樣本按Z值歸類，抽取70例21、18、13號染色體陰性樣本，21、18、13號染色體陽性樣本各2例，由培訓(xùn)合格的NIPT實驗技術(shù)員(操作者均培訓(xùn)并取得獲得PCR上崗證書和產(chǎn)前診斷母嬰保健技術(shù)培訓(xùn)合格證書)在醫(yī)院實驗室重做NIPT，獲得Z值并與第一次給予比較分析。

3.提純DNA：從-20 ℃冰箱取出血漿樣本解凍，離心。在干凈的BD管中加入磁珠等相關(guān)試劑備用。離心完將上清轉(zhuǎn)移到BD管中，在垂直混勻儀混勻。在磁力架沉淀BD管中的磁珠。將磁珠轉(zhuǎn)移到磁力架上的中轉(zhuǎn)管中，用wash buffer漂洗磁珠，吸干殘液。加入EB buffer 洗脫。瞬時離心收集，將DNA溶液轉(zhuǎn)移到新EP管中，-20 ℃凍存。

4.高通量測序文庫構(gòu)建：取出DNA樣本解凍，瞬時離心收集。冰上操作，配制反應(yīng)Mix1，分裝到PCR管。再加入DNA，迅速混勻，在PCR儀中反應(yīng)。反應(yīng)完后，樣本取出放在冰上。配制Mix2，分裝到PCR管。再加入Adaptor T混勻，在PCR儀中反應(yīng)。在中轉(zhuǎn)EP管分裝平衡好的磁珠。再加入樣本并混勻。室溫放置片刻。瞬時離心收集，置于磁力架上吸附磁珠。吸棄上清，用wash buffer洗滌磁珠。瞬時離心收集，吸取殘液。室溫晾干，加入洗脫液重懸。瞬時離心收集，置于磁力架上吸附磁珠。吸取洗脫文庫到新EP管中，-20 ℃凍存。

5.qPCR定量：-20 ℃取出上述文庫樣本、濃度標(biāo)準(zhǔn)品、DNA standards解凍。將18 μl的稀釋液分裝到0.5 ml EP管中。每個樣本取2 μl加入，漩渦震蕩混勻。另將198 μl的稀釋液分裝到0.5 ml EP管中。加入2 μl 濃度標(biāo)準(zhǔn)品，漩渦震蕩混勻。濃度標(biāo)準(zhǔn)品做3重復(fù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線做5個點，一個陰性對照(NTC，稀釋液)。依據(jù)說明書配制反應(yīng)Mix，分裝到qPCR版中。加入稀釋好的樣本、濃度標(biāo)準(zhǔn)品及DNA standards、NTC。封口離心。qPCR儀檢測，根據(jù)qPCR結(jié)果判斷文庫構(gòu)建情況并換算文庫濃度。

6.混合文庫：制定混合文庫方案，篩選出所要混合文庫樣本，根據(jù)文庫濃度，給出合適的參考混合量及混合后的理論濃度。打印混合文庫方案。對照方案找出所要混合文庫的文庫樣本，并將文庫樣本混合?；旌虾煤?，進行qPCR定量，方法如上。

7.高通量測序平臺高通量測序：準(zhǔn)備新的Reagent Cartridge：解凍，檢查。NextSep CN500運行清洗程序一次。計算所需混合文庫、NaOH體積。將混合文庫和NaOH依次加入EP管中，振蕩混勻。室溫靜置變性。將NaOCl、變性后的文庫加入Reagent Cartridge。運行測序程序，根據(jù)提示裝載Flow Cell，Buffer Cartridge，Reagent Cartridge，輸入運行參數(shù)并核對。檢查Pre-Run結(jié)果。無異常即選擇Start Run，監(jiān)控Run運行。Run完成后清洗儀器。Run數(shù)據(jù)輸送到分析平臺進行分析。

8.數(shù)據(jù)分析：添加上述樣本的信息到貝比安TM數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。上機完成后提交分析。分析完成后，查看分析報告。21、18、13號染色體Z值在(-3.0，3.0)判斷為陰性，≥3.0為陽性。Z值代表計算每條染色體所占比例的評分結(jié)果，計算公式為：Z值=(染色體唯一比對序列數(shù)目占常染色體的百分比-參照樣品組染色體比例平均值)/參照樣品組染色體比例標(biāo)準(zhǔn)偏差

9.統(tǒng)計學(xué)處理：兩次NIPT實驗Z值采用SPSS 13.0進行Pearson相關(guān)系數(shù)分析。變量的相關(guān)強度判斷，相關(guān)系數(shù)0.8～1.0極強相關(guān)；0.6～0.8強相關(guān)；0.4～0.6中等程度相關(guān)；0.2～0.4 弱相關(guān)；0.0～0.2極弱相關(guān)或無相關(guān)。

結(jié) 果

NIPT實驗后，分析結(jié)果提示陽性對照為Chr21/Chr18/Chr13高風(fēng)險，即結(jié)果為陽性，判定整張芯片的分析結(jié)果有效。76例樣本順利完成實驗，上機數(shù)據(jù)分析正常。分別對70例21、18、13號染色體陰性樣本兩次Z值作為豎軸，樣本序號作為橫軸作散點連線圖(圖1、圖2、圖3)；對6例T13、T18及T21樣本兩次Z值，以Z值為縱軸，樣本種類為橫軸作柱形圖(圖4)。

圖1中將70例13號染色體陰性樣本的第一次檢測的Z值從小到大排列，并做線性回歸分析，提示Z值為線性遞增，y=0.0594x-2.5129，R2=0.9778；與之對應(yīng)的第二次結(jié)果提示非線性y=0.029x-1.0716，R2= 0.331。兩次Z值的Pearson相關(guān)系數(shù)為r=0.594，顯示兩組數(shù)據(jù)中等相關(guān)，總體來看多數(shù)樣本的兩次Z值有浮動。第二次結(jié)果均在(-3.0，3.0)區(qū)間內(nèi)，與第一次結(jié)果一致。

圖1 70例13號染色體陰性樣本的兩次Z值對比

圖2兩次18號染色體Z值結(jié)果一致，且同樣有浮動。第一次結(jié)果從低到高線性遞增，y=0.0623x-2.2208，R2=0.9689；對應(yīng)的，第二次結(jié)果則非線性，y=0.0172x-0.4768，R2=0.133。兩次Z值的Pearson相關(guān)系數(shù)為r=0.356，兩次結(jié)果弱相關(guān)。

圖2 70例18號染色體陰性樣本的兩次Z值對比

圖3兩次21號染色體Z值結(jié)果一致，同樣有浮動，浮動幅度最大達到4.00。第一次結(jié)果從低到高線性遞增，y=0.0559x-2.3188，R2=0.9621 ；與之對應(yīng)的第二次則并無線性關(guān)系，y=0.0154x-0.6026，R2=0.0697。兩次Z值的Pearson相關(guān)系數(shù)為r=0.224，兩次結(jié)果為弱相關(guān)。

圖3 70例21號染色體陰性樣本的兩次Z值對比

圖4中6例陽性樣本的兩次結(jié)果一致。兩次Z值之間有一定的浮動，且均在(3.0，+∞)區(qū)間內(nèi)所有樣本兩次檢測結(jié)果的Z值之間有一定的浮動，陰性樣本檢測結(jié)果的Z值均在(-3.0，3.0)，陽性樣本兩次檢測結(jié)果的Z值均高于3.0，第一次與第二次檢查結(jié)果的Z值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

圖4 6例T13、T18或T21樣本NIPI兩次Z值對比

討 論

NIPT技術(shù)基于母血游離的胎兒DNA含量與孕周變化關(guān)系[1-2]及整倍體與非整倍體之間的胎兒游離DNA含量差異關(guān)系[3]。精確地檢測出胎兒游離DNA含量也就成為了NIPT準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。一是排除母源性、胎源性的干擾因素；二是控制實驗流程帶來的誤差。目前，國際上在排除母源性、胎源性[4]的干擾均取得了突破。而后者由于NIPT檢測程序復(fù)雜，如標(biāo)本保存、試劑耗材的運輸與質(zhì)保、檢測系統(tǒng)的運行狀態(tài)和實驗操作人員的素質(zhì)等，稍有不當(dāng)都會導(dǎo)致胎兒游離DNA含量改變，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。《高通量基因測序產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范(試行)》規(guī)定的產(chǎn)前診斷機構(gòu)剩余的血漿樣本應(yīng)保存至產(chǎn)后2年以上備用，因此，開展NIPT的實驗室應(yīng)進行后續(xù)標(biāo)本庫的建設(shè)。醫(yī)院實驗室是個多種實驗并行開展的大環(huán)境，本實驗室目前多為多種實驗并行開展，在實驗條件控制方面不可能完全達到理想要求。本實驗旨在醫(yī)院實驗室條件下，進行一次NIPT檢測，評估該實驗的可行性。本課題組將后續(xù)開展不同時間段樣本的復(fù)檢以及評價實驗。

表1 兩次檢測結(jié)果的Z值比較

NIPT技術(shù)是通過生物信息學(xué)手段及數(shù)學(xué)方法分析胎兒染色體非整倍體(T21、T18和T13)情況的，其獲得的Z值[5-6]代表計算每條染色體所占比例的評分結(jié)果，是通過GC校正后的染色體比值，使所有染色體處于同一水平上比對。實驗將通過比較兩次Z值變化，判斷NIPT定性結(jié)果的重復(fù)性。本實驗結(jié)果顯示兩次NIPT實驗的定性結(jié)果是一致的，盡管各染色體的Z值有較小的浮動，但Z值雖是數(shù)值，卻是定性結(jié)果。陰性樣本的Z值在(-3.0，3.0)范圍內(nèi)判定變化差異無意義，相對的陽性樣本的Z值在[3.0，+∞)范圍內(nèi)變化差異也無意義。而導(dǎo)致這些浮動可能因素可能有以下幾點。首先實驗材料為同一個樣本分離出平行三管的血漿，但本次所用血漿經(jīng)歷了長時間凍存，兩次凍融，致使所用樣本中胎兒的DNA含量出現(xiàn)一定波動，但結(jié)果上沒有變化。因此，標(biāo)本分離多管(至少三管)是極為必要的，可以備失控時實驗重復(fù)及長期凍存樣本；其次，實驗環(huán)境不同，試劑批次不同，測序儀控制軟件版本升級，由不同實驗員操作等多種實驗條件的改變，可能出現(xiàn)的誤差。特別應(yīng)注意的是，NIPT大部分的實驗屬于手工操作，經(jīng)過嚴(yán)格定期培訓(xùn)的人員和符合要求條件的實驗室硬件是保證質(zhì)量的必備條件，但要心存隱患意識，及時排除差錯隱患。本實驗室開展NIPT實驗均嚴(yán)格雙人雙錄核對，及時排除了差錯隱患。鑒于陰性、陽性樣本的定性結(jié)果與第一次保持一致，當(dāng)前實驗條件導(dǎo)致的差異并不影響定性結(jié)果。這說明該NIPT檢測平臺的穩(wěn)定性很好，在一定程度上適應(yīng)醫(yī)院實驗室中的各種實驗環(huán)境變化，滿足政策的要求。

經(jīng)過多次預(yù)實驗及改善磨合，通過衛(wèi)生部的室間質(zhì)評，在三甲醫(yī)院PCR實驗室開展NIPT是可行的。NIPT各環(huán)節(jié)諸多技術(shù)限制因素依舊存在，仍需不斷對NIPT技術(shù)進行優(yōu)化改進。

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