田萬年，李香子，夏廣軍，金 鑫，嚴(yán)昌國*

（1．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林吉林 132101；2． 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林 132101；3． 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002）

不同發(fā)育階段延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達(dá)基因的篩選

田萬年1,2，李香子3，夏廣軍3，金 鑫3，嚴(yán)昌國3*

（1．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林吉林 132101；2． 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林 132101；3． 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002）

應(yīng)用引物退火控制技術(shù)（ACP）篩選8月齡和30月齡延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達(dá)基因，尋找與延邊黃牛生長發(fā)育相關(guān)的候選基因。相同飼養(yǎng)條件下，分別檢測(cè)3頭8月齡和30月齡延邊黃牛閹牛背最長肌組織的mRNA表達(dá)水平變化。利用20對(duì)隨機(jī)引物差異顯示擴(kuò)增，共獲得9條ESTs。對(duì)Telethonin、MYH7、MSTN、Camk2d和SPP1基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明：MYH7、 MSTN和SPP1基因在8月齡閹牛組背最長肌中的表達(dá)量顯著高于30月齡（P＜0．05）；Telethonin和Camk2d在30月齡閹牛背最長肌中的表達(dá)量顯著高于8月齡（P＜0．05）。結(jié)果提示，這些基因可能是影響延邊黃牛生長及肉質(zhì)性狀的重要調(diào)控基因。

延邊黃牛；引物退火控制技術(shù)；差異表達(dá)基因；熒光定量PCR

骨骼肌的發(fā)育調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜基因調(diào)控，涉及到大量基因的表達(dá)及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，鑒定這些基因表達(dá)對(duì)闡明牛肌肉生長和肉質(zhì)性狀的分子機(jī)制以及提高牛肉質(zhì)量具有重要意義[1]。研究結(jié)果表明，動(dòng)物生長發(fā)育的不同階段存在不同的基因表達(dá)機(jī)制，一些影響動(dòng)物生長、肉質(zhì)性狀的候選基因具有表達(dá)的時(shí)序性。賀花[2]對(duì)秦川牛胚胎期（135 d）和成年期（30月齡）背最長肌差異基因進(jìn)行了篩選，獲得了秦川牛背最長肌發(fā)育過程中肉質(zhì)、生長性狀差異表達(dá)基因。秦立紅[3]對(duì)草原紅牛初生公牛與成年公牛背最長肌組織差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選，獲得了肉質(zhì)性狀、生長發(fā)育性狀以及抗病性狀差異基因。唐榮莉等[4]對(duì)16月齡和5歲齡蒙古牛臀肌組織差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析。恒聰聰?shù)萚5]報(bào)道，胎兒時(shí)期MyoD基因在肌肉中表達(dá)量較低，隨時(shí)間推移表達(dá)量逐漸增加，30月齡表達(dá)量達(dá)到最高。張小輝等[6]報(bào)道，18、24月齡IGF基因家族在南陽牛肌肉組織中的表達(dá)量與3月齡相比顯著降低。目前，有關(guān)延邊黃牛不同生長階段背最長肌差異表達(dá)基因研究，國內(nèi)尚未見報(bào)道。

延邊黃牛是我國五大良種黃牛之一。2008年，延邊黃牛（肉用）品種被評(píng)為東北第一個(gè)肉牛品種。延邊黃牛具有抗寒性能好、耐粗飼、抗病性強(qiáng)、容易育肥等特點(diǎn)。牛肉細(xì)嫩多汁，鮮美可口，深受消費(fèi)者青睞。由于長期向役用方向選育，延邊黃牛與國外優(yōu)良肉牛品種相比，存在前軀發(fā)育較好但后軀發(fā)育偏弱、產(chǎn)肉性能較低等特點(diǎn)。目前，延邊黃牛分子遺傳資源研究主要從候選基因角度分析與生長、肉質(zhì)相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記[7-10]。利用分子生物學(xué)技術(shù)篩選影響生長、肉質(zhì)性狀的功能基因可以提高尋找候選基因的工作效率，對(duì)促進(jìn)延邊黃牛選育改良具有重要意義。本試驗(yàn)采用引物退火控制技術(shù)（Annealing Control Primer, ACP），對(duì)8月齡和30月齡延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，了解二者背最長肌基因差異表達(dá)概況，獲得影響生長、肉質(zhì)性狀候選基因，為延邊黃牛肉用改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 選擇6頭遺傳背景相同、健康且同一月齡、體重相近的延邊黃牛公犢牛，在相同環(huán)境條件下飼養(yǎng)，4月齡進(jìn)行去勢(shì)，分別在8月齡和30月齡各屠宰3頭閹牛，屠宰后采集背最長肌，取樣后分裝到一次性手套中，紗布包緊后立即放入液氮凍存，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 方法

1．2．1 總RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法分別提取6頭牛背最長肌總RNA，溶于20 μL不含RNase的DEPC處理水中。分別取3 μL RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA的完整性，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度。對(duì)提取到的8月齡和30月齡閹?？俁NA（0．25 μg/μL）各取10 μL組成總RNA池30 μL，冰浴5 min。以O(shè)ligo（dT15）ACP為3′端引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈?？偡磻?yīng)體系為20 μL：總RNA 2 μg、10×Buffer 4 μL、dNTP（2．5 mmol/L）、dT-ACP1 2 μL、RNase Inhibitor 0．5 μL、SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶1 μL。置42℃ 60 min、94℃ 5 min、冰浴5 min終止反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用滅菌去離子水5倍稀釋，-20℃保存?zhèn)溆谩?．2．2 背最長肌差異表達(dá)基因的篩選 應(yīng)用GeneFishingTMDEG kit試劑盒（Seegene公司）20對(duì)隨機(jī)引物ACP同dT-ACP2組合分別對(duì)8月齡和30月齡閹牛cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL：dT-ACP2（1 μmol/L）2．5 μL、隨機(jī)引物（1 μmol/L）5 μL、dNTP（200 μmol/ L）4 μL、Taq（2．5 U）0．5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、cDNA模板5 μL、去離子水28 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃變性5 min，50℃退火3 min，72℃延伸1 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40 s，65℃退火40 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠分析系統(tǒng)掃描記錄，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1．2．3 差異基因克隆與序列分析 根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果，紫外燈下切割差異條帶，回收純化差異片段，進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆質(zhì)粒送往上海英俊生物有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果去除載體序列后在NCBI進(jìn)行同源性比對(duì)。

1．2．4 實(shí)時(shí)定量PCR分析 以牛β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Primer Premier 5．0軟件對(duì)獲得的差異基因序列設(shè)計(jì)引物（表1）。提取8月齡和30月齡閹?？俁NA后，采用Prime ScriptTMRT-PCR 試劑盒（TaKaRa 公司）制備cDNA，然后用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa 公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。計(jì)算各個(gè)樣品目的基因的Ct值和各自內(nèi)參β-actin的Ct值，基因表達(dá)水平以相對(duì)表達(dá)量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，并用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)樣本進(jìn)行單因素方差分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2．1 延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達(dá)基因 通過20對(duì)ACP引物PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳共獲得9條8月齡和30月齡閹牛個(gè)體背最長肌差異表達(dá)ESTs，結(jié)果見圖1。

2．2 差異片段的同源性比較分析 將差異片段回收后進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序獲得的各個(gè)序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，共獲得9條牛的cDNA序列，與8月齡閹牛相比，有6個(gè)基因在30月齡閹牛背最長肌中表達(dá)水平下調(diào)，3個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)，見表2。

2．3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)部分差異基因 以牛β-actin基因?yàn)閷?duì)照，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖2。MYH7、MSTN和SPP1基因在8月齡延邊黃牛閹牛背最長肌中的mRNA表達(dá)豐度顯著高于30月齡個(gè)體（P＜0．05）。Telethonin和Camk2d基因在30月齡延邊黃牛閹牛背最長肌中的mRNA表達(dá)豐度顯著高于8月齡個(gè)體（P＜0．05）。

圖1 差異表達(dá)基因片段篩選電泳圖結(jié)果

圖2 部分差異基因的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果

表2 延邊黃牛閹牛背最長肌部分差異表達(dá)基因

3 討 論

ACP技術(shù)是Hwang等[11]建立的一種鑒定差異表達(dá)基因的方法，已在動(dòng)物發(fā)育和植物相關(guān)差異表達(dá)基因的克隆中得到廣泛應(yīng)用。吳奎等[12]利用ACP技術(shù)對(duì)尼羅羅非魚雌雄魚肌肉組織差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選，共獲得8條ESTs。賈錫偉等[13]利用ACP技術(shù)對(duì)日本囊對(duì)蝦性腺差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。本實(shí)驗(yàn)通過ACP技術(shù)對(duì)2個(gè)發(fā)育階段（8月齡和30月齡）延邊黃牛閹牛肌肉組織中共篩選獲得9條表達(dá)序列標(biāo)簽。應(yīng)用熒光定量PCR方法對(duì)其中5個(gè)差異基因進(jìn)行了鑒定，Telethonin、SPP1基因在30月齡延邊黃牛閹牛背最長肌中的表達(dá)量顯著高于8月齡。MYH7、MSTN和Camk2d基因在8月齡延邊黃牛閹牛背最長肌中的表達(dá)量顯著高于30月齡。初步篩選到Telethonin、SPP1、MYH7、MSTN和Camk2d等基因可能是調(diào)控延邊黃牛閹牛肉質(zhì)、生長性狀的重要基因。

通過對(duì)篩選到的差異表達(dá)基因深入分析發(fā)現(xiàn)，參與細(xì)胞代謝的細(xì)胞因子信號(hào)負(fù)調(diào)控因子-8（ASB8）在8月齡延邊黃牛閹牛背最長肌中表達(dá)上調(diào)。楊忠誠等[14]研究發(fā)現(xiàn)，咸寧黃牛SOCS4基因多態(tài)性與生長性狀存在關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ASB8基因可能與延邊黃牛肌肉分化相關(guān)，該基因在延邊黃牛生長發(fā)育過程中具有重要作用。鈣/鈣調(diào)依賴性蛋白激酶Ⅱ（Calcium/Calmodulin-Dependent protein Kinase II,CAMK II）是一種體內(nèi)廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由α、β、γ、δ4種亞基組成。目前已發(fā)現(xiàn)，CAMK II基因參與多種細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控[15]。鈣/鈣調(diào)依賴性蛋白激酶Ⅱδ亞基（Camk2d）是該家族成員之一，在體內(nèi)廣泛表達(dá)[16]。劉勇等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Camk2d基因在大鼠脂肪組織中表達(dá)，參與了脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控。肌內(nèi)脂肪是影響牛肉品質(zhì)的重要因素之一，脂肪含量的多少將影響牛肉的風(fēng)味和嫩度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Camk2d基因在30月齡延邊黃牛背最長肌表達(dá)量顯著降低，提示該基因可能是影響延邊黃牛肉質(zhì)性狀的重要基因。

基因與骨骼肌的構(gòu)成密切相關(guān)。Telethonin是一種重要的肌節(jié)蛋白，在肌原纖維的組裝過程中發(fā)揮重要的作用[18]。肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）最顯著作用是對(duì)骨骼肌的生長具有負(fù)調(diào)控作用，通過抑制動(dòng)物成肌細(xì)胞的增殖和分化抑制骨骼肌生長發(fā)育。MSTN基因已被證實(shí)與動(dòng)物生長性狀密切相關(guān)。閔令江等[19]研究顯示，山羊MSTN基因多態(tài)性與山羊肉用性狀顯著相關(guān)。梁春年等[20]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛MSTN基因內(nèi)含子2多態(tài)性與生長性狀顯著相關(guān)。目前，MSTN基因在動(dòng)物肌肉發(fā)育過程中表達(dá)的變化已有研究報(bào)道。劉丹等[21]研究發(fā)現(xiàn)隨著豬日齡增加，MSTN基因表達(dá)量顯著下降。Nicholas等[22]研究發(fā)現(xiàn)Telethonin能夠調(diào)節(jié)MSTN分泌，抑制MSTN的活性。本實(shí)驗(yàn)中Telethonin在30月齡延邊黃牛閹牛肌肉中高表達(dá)，而MSTN基因低表達(dá)，提示以上2個(gè)基因在延邊黃牛生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。在篩選到的差異表達(dá)基因中，將Telethonin和MSTN差異片段回收后進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序獲得的各個(gè)序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，共獲得9條牛的cDNA序列，與8月齡閹牛相比，有6個(gè)基因在30月齡閹牛背最長肌中表達(dá)水平下調(diào)，3個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)。本研究對(duì)不同發(fā)育階段延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達(dá)基因進(jìn)行了初步篩選，為延邊黃牛分子育種提供了理論基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)中只通過20對(duì)ACP引物進(jìn)行了差異基因的初步篩選，獲得差異基因較少，下一步應(yīng)進(jìn)一步挖掘影響延邊黃牛生長、肉質(zhì)性狀的基因。

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Screening and Ιdentif i cation of the Dif f erentially Expressed Genes in Dif f erent Development Stages of Yanbian Steers Longissimus Dorsi Muscles

TⅠAN Wan-nian1,2, LⅠ Xiang-zi3, XⅠA Guang-jun3, JⅠN Xin3, YAN Chang-guo3*
(1. College of Animal Science, Jilin Agricultural Science And Technology College, Jilin Jilin 132101,China; 2. Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province, Jilin Jilin 132101,China; 3. College of Agriculture, Yanbian University, Jilin Yanji 133002,China)

Annealing control primer (ACP) system was applied to find differentially expressed genes(DEGs) in the longissimus dorsi muscle between 8 and 30 months of age. Using 20 arbitrary ACP primers, we identif i ed and sequenced 9 DEGs. The expression patterns were conf i rmed for fi ve genes (Telethonin,MYH7, MSTN, Camk2dandSPP1) using realtime PCR. The expressions ofMYH7,MSTNandSPP1were higher in the 8 months old than that in 30 months (P＜0.05), The expressions of theCamk2dandTelethoninwere higher in the 30 months than that in 8 months (P＜0.05). All the DEGs were screened by ACP system, which may considered as the most important genes involved in growth and meat quality traits.Key words: Yanbian yellow cattle; Annealing control primer (ACP) system; Differential expression genes(DEGs); Real-time quantitative PCR

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-040

2016-07-06；

2016-07-28

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20150623004TC）；吉林省重點(diǎn)學(xué)科培育項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字[2015]第x030號(hào)）；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子基金項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字[2014]第Z07號(hào)）

田萬年（1980-），男，吉林長春人，講師，博士，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail:wannian2000@hotmail．com

* 通訊作者：嚴(yán)昌國（1960-），男，吉林延吉人，教授，主要從事黃牛育種研究，E-mail: ycg@ybu．edu．cn