朱惠香 張荷萍 龔海英

浙江省義烏稠州醫(yī)院 浙江 義烏 322000

升白湯對60Co射線所致小鼠骨髓有核細(xì)胞周期的影響

朱惠香 張荷萍 龔海英

浙江省義烏稠州醫(yī)院 浙江 義烏 322000

升白湯 60Co射線 骨髓 細(xì)胞周期 實(shí)驗(yàn)研究

近年來由于種種原因，白細(xì)胞減少癥的發(fā)生率正呈逐步上升趨勢，是臨床醫(yī)生經(jīng)常要面臨的醫(yī)療問題。本院自擬的經(jīng)驗(yàn)方“升白湯”為基本方辨證分型加減，該方為健脾補(bǔ)腎、益氣生血方，在臨床升白治療中有一定療效。為進(jìn)一步觀察升白湯對白細(xì)胞減少癥的作用，本文考察了該方對骨髓有核細(xì)胞周期的影響，以便進(jìn)一步明確升白湯對輻射損傷所致白細(xì)胞減少的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料:分述如下。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級ICR小鼠，雄性，共85只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22g，由浙江省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號:SYXK(浙)2014-0003）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品:①升白湯:生黃芪、黃精、仙鶴草各30g，仙靈脾、雞血藤各15g，女貞子、當(dāng)歸各12g。以上中藥用水浸泡10小時(shí)后，再行煎煮，共2次，每次1小時(shí)，合并煎液，離心，濃縮，分別稀釋至藥液濃度為3.80g生藥/ml、1.90g生藥/ml、0.95g生藥/ml 3種濃度,分別相當(dāng)于成人用量的16倍、8倍、4倍。②利可君片（購于江蘇吉爾貝藥業(yè)，批號150606），臨用前用蒸餾水溶解稀釋，配成1mg/ml的溶液。

1.1.3 主要儀器:酶標(biāo)儀（Bio-RAD公司680，美國）；臺式離心機(jī)（Biofogepico，Heraeus公司，德國）；電子天平（METTLER TOLEDO AB204-S，瑞典）；解剖顯微鏡（OLYMPUS SZ-11，日本）；生物顯微鏡（OLYMPUS，CHK2-FGS日本）。

1.1.4 主要試劑:小鼠γ干擾素（中美生命科技公司，批號:E0049m）；小鼠粒細(xì)胞因子（中美生命科技公司，批號:E0045m）；冰醋酸（分析純，杭州化學(xué)試劑廠，批號: 150626）。

1.2 分組及給藥:分述如下。

1.2.1 動(dòng)物分組:85只小鼠，隨機(jī)共分6組，正常組10只，模型組、升白湯大劑量組、中劑量組、小劑量組及利可君組（陽性組）隨機(jī)各15只。

1.2.2 給藥方式:正常組、模型組:灌胃給予生理鹽水25ml/kg，1次/日。大劑量組:升白湯3.8g生藥/ml灌胃，1次/日。中劑量組:升白湯1.9g生藥/ml灌胃，1次/日。小劑量組:升白湯0.95g生藥/ml灌胃，1次/日。陽性組:利可君20mg/kg、1mg/ml灌胃，1次/日。

1.3 造模:以上各組灌胃14天后，除正常組外，其余各組均施行一次性60Co射線全身照射，吸收總劑量為3.5Gy，由浙江省農(nóng)科院輻照中心施行。

1.4 骨髓有核細(xì)胞周期的測定：于照射造模后14天，處死動(dòng)物，分離出2側(cè)股骨。取左側(cè)股骨中段7mm，用0.005mol/LCaCl2溶液10ml將全部骨髓沖入離心管內(nèi)，搗碎，加生理鹽水混懸，將細(xì)胞以1×106接種于60mm培養(yǎng)板，80%匯合后轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后在新鮮培養(yǎng)液中加入適當(dāng)?shù)目股兀ㄕ婧吮磉_(dá)載體上的抗性標(biāo)記）進(jìn)行培養(yǎng)，48小時(shí)后用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗兩遍，棄上清，加入1ml 70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定12小時(shí)以上。PBS洗滌去乙醇，1000rpm,5min，洗兩遍。0.5mlPBS重懸細(xì)胞，加入PI和RNaseA至終濃度50μg/ml，37℃溫浴30min。用流式細(xì)胞儀測定周期。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況:至實(shí)驗(yàn)第14天，正常組死亡0只；模型組死亡5只；陽性組死亡3只；升白湯小劑量組死亡1只；升白湯中劑量組死亡2只；升白湯大劑量組死亡3只。

2.2 對小鼠外周血WBC計(jì)數(shù)的影響:輻射后第3天各輻照組小鼠外周血WBC計(jì)數(shù)明顯減少，與正常組比較差異均有顯著性（P＜0.01）。在輻射后第7天，各輻射組與正常組WBC比較差異仍有顯著性（P＜0.01）；同模型組比較，升白湯大、中、小劑量組及陽性組小鼠外周血WBC計(jì)數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）；同陽性組比較，升白湯三個(gè)劑量組小鼠外周血WBC計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在輻射后第10、14天，升白湯各劑量組小鼠外周血WBC計(jì)數(shù)與模型組比較有明顯回升，差異有顯著性（P＜0.05），其中中劑組與模型組比較，差異更有顯著性（P＜0.01）。在輻射后第10天，升白湯各劑量組外周血WBC計(jì)數(shù)回升與陽性組比較無顯著性差異（P＞0.05）；在輻射后第14天，中劑量組與陽性組比較有顯著性差異（P＜0.05），大、小劑量組與陽性組比較無顯著性差異（P＞0.05）。具體見表1。

表1 升白湯對60Co輻射小鼠WBC計(jì)數(shù)的影響（±s，×109/L）

表1 升白湯對60Co輻射小鼠WBC計(jì)數(shù)的影響（±s，×109/L）

注:與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＄P＜0.05,＄＄P＜0.01；升白湯各組與陽性組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組陽性組小劑量組中劑量組大劑量組例數(shù)10 10 12 14 13 12照射后小鼠WBC計(jì)數(shù)（109/L）3天13.13±3.25 2.33±0.82**2.41±0.63**2.52±0.91**2.46±0.29**2.47±0.76**7天11.46±2.66 1.26±0.73**1.43±0.38**1.50±0.37**1.48±0.74**1.28±0.39**10天10.33±3.05 1.70±0.49 2.52±0.83＄2.49±0.86＄3.02±0.79＄＄2.60±0.44＄14天10.11±2.45 1.79±0.39 2.67±0.83＄2.55±0.72＄3.27±1.33＄＄#2.68±0.79＄

2.3 對小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)（BMNC）的影響:接受60Co照射后，各輻射組小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)均較正常組顯著減少（P＜0.05）。升白湯三個(gè)劑量組及陽性組小鼠的骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)較模型組顯著增加（P＜0.05），其中升白湯中劑量組BMNC計(jì)數(shù)與陽性組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。作用強(qiáng)弱順序?yàn)?升白湯中劑量組＞陽性組＞大劑量組＞小劑量組。

2.4 對骨髓有核細(xì)胞周期的影響:見表2。

表2 升白湯對60Co輻射小鼠骨髓有核細(xì)胞周期的影響（±s）

表2 升白湯對60Co輻射小鼠骨髓有核細(xì)胞周期的影響（±s）

注:與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，$P＜0.05。

組別正常組模型組陽性組小劑量組中劑量組大劑量組例數(shù)10 10 12 14 13 12細(xì)胞周期G0/G1 68.24±3.25 63.15±2.17 60.32±4.47 54.02±2.03*55.69±3.34*56.05±1.58*S 24.02±1.28 27.35±2.56 32.22±1.95*36.02±3.10*$35.69±2.75*$35.62±1.02*$G2/M 6.33±0.36 8.65±1.25*7.32±0.88 10.01±1.03*9.87±0.69*9.98±1.45*PI（%）29.28±1.38 34.85±3.04 38.86±2.41 44.35±5.24*$44.06±2.87*$43.86±2.52*$

3 討論

白細(xì)胞減少癥屬中醫(yī)學(xué)“虛勞”范疇[1]，其主要病機(jī)為脾腎虧損，氣血不足。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主藏精，主骨生髓，精能化血，精血同源，精足則血旺。脾主運(yùn)化水谷精微，為氣血生化之源。因此，人體造血功能與脾腎的關(guān)系最為密切。研究表明，健脾補(bǔ)腎和補(bǔ)血養(yǎng)陰的中藥對促進(jìn)骨髓造血有顯著療效[2]。故血虛當(dāng)從脾腎論治，補(bǔ)益氣血，升白湯即集補(bǔ)腎生血、健脾益氣于一方。骨髓細(xì)胞周期是反映造血系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)之一[3],白細(xì)胞減少癥患者均不同程度表現(xiàn)出骨髓有核細(xì)胞周期的抑制。細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相反映骨髓細(xì)胞增殖的狀態(tài)。在細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制中有兩個(gè)重要的檢查點(diǎn)，分別位于G1期與S期，G2期與M期之間。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)輻射后小鼠骨髓BMNC數(shù)較正常組有明顯下降，提示輻射對造血系統(tǒng)損傷明顯。各藥物干預(yù)組同模型組比較，可顯著提高小鼠骨髓BMNC計(jì)數(shù)，其中升白湯中劑量組療效最顯著。BMNC計(jì)數(shù)在一定程度上反應(yīng)骨髓造血細(xì)胞的增生情況，研究證明升白湯可促進(jìn)BMNC增加，改善輻射所致的造血系統(tǒng)損害，促進(jìn)造血功能的恢復(fù)。

本研究結(jié)果顯示，受照后小鼠細(xì)胞周期時(shí)相表現(xiàn)為S延長及G2期延長，升白湯組與正常組、病理組比較，S期明顯延長(P＜0.05)；G2期較正常組亦明顯延長。其時(shí)相敏感點(diǎn)不同說明了劑量對周期時(shí)相有著重要影響。

[1]陳慧娟，李立群.升血湯治療化療后白細(xì)胞減少癥42例療效觀察[J].浙江中醫(yī)雜志，2013，48(7):510.

[2]梁冰.血液科?？浦嗅t(yī)臨床診治[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:415-418.

[3]張迪，徐桂華.中藥對化療致白細(xì)胞減少癥治療機(jī)制研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,14（3）:53-55.

2016-11-13