李友偉，周 薇，周 洋*，葉 鳴，周 鴻

(1.德陽市人民醫(yī)院肝膽外科，四川 德陽 618000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院，成都市第三人民醫(yī)院超聲科，四川 成都 600031)

·基礎(chǔ)與實驗研究·

載10-羥基喜樹堿的葉酸受體靶向相變超聲造影劑的制備及一般特性

李友偉1，周 薇2，周 洋2*，葉 鳴2，周 鴻2

(1.德陽市人民醫(yī)院肝膽外科，四川 德陽 618000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院，成都市第三人民醫(yī)院超聲科，四川 成都 600031)

目的 制備一種載10-羥基喜樹堿(10-HCPT)的葉酸受體靶向相變納米粒超聲造影劑(FR-HCPT-PNPCA)，評價其載藥及在體外的相變能力、對腫瘤細胞的靶向能力等一般特性。方法 通過雙步乳化法制備以脂質(zhì)為殼膜材料、液態(tài)氟碳為內(nèi)核，且包裹抗癌藥物10-HCPT的納米粒，采用高效液相色譜研究其藥物包封率和載藥量，在體外通過加熱法研究其相變產(chǎn)生微泡的能力，并在肝癌細胞株7721細胞上研究其體外尋靶能力。結(jié)果 成功制備出載10-HCPT的靶向相變納米粒FR-HCPT-PNPCA，其藥物包封率為70.42%，載藥量為20.05%。當(dāng)加熱至70℃時，顯微鏡下可以觀察到明顯的相變并產(chǎn)生微氣泡，且大量納米?？商禺愋缘仞じ接诟伟┘毎車?。結(jié)論 FR-HCPT-PNPCA載藥率高，性質(zhì)穩(wěn)定，靶向腫瘤能力強，有望成為一種集腫瘤診治于一體的多功能超聲分子探針，具有良好的應(yīng)用前景。

10-羥基喜樹堿；葉酸；靶向；相變；造影劑

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康和生存質(zhì)量，然而對于多數(shù)腫瘤，無論臨床診斷技術(shù)還是現(xiàn)有的治療手段，都無法取得非常滿意的效果。近年來，隨著分子影像學(xué)的發(fā)展，在分子水平上診治腫瘤中，分子探針的研發(fā)有至關(guān)重要的作用[1]。作為分子影像學(xué)的重要分支，超聲分子影像學(xué)同樣受制于超聲分子探針研制。因此，在超聲微泡造影劑的基礎(chǔ)上，各種類型的超聲分子探針，如納米分子探針、靶向分子探針、載藥分子探針、相變分子探針及多模態(tài)分子探針等都得到了不同程度的研發(fā)，但卻面臨一些問題，如制備工藝復(fù)雜、靶標(biāo)不穩(wěn)定表達、載藥量低、不能穿透血管內(nèi)皮間隙等[2]。本研究基于課題組既往對靶向相變分子探針的研究基礎(chǔ)[3]，制備一種腫瘤細胞穩(wěn)定表達、葉酸受體靶向、載10-羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecin， 10-HCPT)的納米粒、且具有相變能力的超聲造影劑(FR-HCPT-PNPCA)，并評價其特性。

1 材料與方法

1.1主要試劑與設(shè)備 成膜材料包括磷脂酰膽堿(DPPC，美國Avanti公司)、偶聯(lián)葉酸的磷脂酰乙醇胺[DSPE(PEG)Folate，美國Avanti公司]、普通磷脂酰乙醇胺(DSPE，美國Avanti公司)、甘油磷脂(DPPG，美國Avanti公司)、泊洛沙姆(PF68，美國Sigma公司)、膽固醇(CH，美國Sigma公司)；內(nèi)核采用液態(tài)氟碳(PFH，法國Elf Atochem公司)；藥物為10-HCPT(成都蘭貝植化科技有限公司)。

主要實驗儀器包括C-MAG HS4型磁力攪拌器(德國IKA)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化)，I25型高速分散均質(zhì)機(德國IKN)，Vcx-130型超聲破碎儀(美國Sonic公司)，倒置熒光顯微鏡(日本 Olympus)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus)，恒溫水浴箱(上海一科儀器設(shè)備公司)，固定溫度的顯微鏡加熱板MicroS37(澳大利亞CryoLogic公司)。

1.2 FR-HCPT-PNPCA的制備和一般性質(zhì)檢測 參照以往實驗[2-3]，將成膜材料和10-HCPT按比例用氯仿和甲醛混合液溶解，經(jīng)磁力攪拌、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜、脫氣水水合后獲得半透明乳液，再以高速分散均質(zhì)機(15 000 rpm，5 min)分散，同時按PFH與乳液體積比1∶8滴加PFH，最后用細胞破碎儀乳化(80% Power，100 s)，獲得乳白色的FR-HCPT-PNPCA乳劑。若成膜材料中不采用DSPE(PEG)Folate，即制得普通非靶向相變?nèi)閯〩CPT-PNPCA，以脫氣水取代PFH制備普通靶向非相變?nèi)閯〧R-HCPT-NPCA。在成膜過程中加入少許綠色熒光染料FITC制備含綠色熒光物質(zhì)的納米粒乳劑。

將上述制備好的乳液稀釋后在光鏡下觀察其形態(tài)及分布，并將樣本送至重慶大學(xué)生物工程學(xué)院檢測其粒徑、電位及濃度。制備的納米粒乳液于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，用前輕微振蕩混勻，保存時間小于4周。

1.3 FR-HCPT-PNPCA藥物包封率和載藥量的測定 將制備的樣品交重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，采用高效液相色譜法測定10-HCPT在納米粒乳液中的含量?；驹O(shè)置如下：色譜柱(150.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動相為乙腈∶水=25∶75，流速1 ml/min，λ=266 nm，T=35℃，進樣量為10 μl。10-HCPT包封率=Cm/Ct×100%，載藥量=Cm/Wt×100%，Cm為FR-HCPT-PNPCA中10-HCPT的含量；Ct為成膜時加入10-HCPT的量；Wt為成膜材料中除去10-HCPT的其他材料的總量。

1.4 FR-HCPT-PNPCA體外尋靶能力 按照常規(guī)貼壁細胞培養(yǎng)和傳代方法，培養(yǎng)人肝癌7721細胞，取對數(shù)生長期的細胞，以每孔1×104的濃度接種于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)制備細胞爬片。靶向?qū)嶒炃耙詿o葉酸的細胞培養(yǎng)液置換基礎(chǔ)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h，加入紅色熒光染料DiI對細胞膜染色，按不同分組進行以下操作：在葉酸受體靶向組加入CO60滅菌的稀釋FR-HCPT-PNPCA乳液100 μl；在空白對照組加入普通HCPT-PNPCA乳劑100 μl，后在各孔內(nèi)加入無葉酸的培養(yǎng)液1 ml，送入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。最后取出培養(yǎng)板，用滅菌PBS液反復(fù)沖洗各孔6次，加入1 ml無葉酸的培養(yǎng)液，于激光共聚焦顯微鏡下觀察納米粒與細胞的結(jié)合情況。

1.5 FR-HCPT-PNPCA的體外相變能力 將顯微鏡加熱板置于顯微鏡載物臺上，其中央孔對準(zhǔn)物鏡中心，將稀釋的相變組FR-HCPT-PNPCA乳液及非相變組FR-HCPT-NPCA乳液滴加于載玻片，蓋上蓋玻片，并將其放于加熱板上加熱，記錄加熱時間和加熱溫度，其間動態(tài)調(diào)節(jié)聚焦觀察納米粒相變產(chǎn)生微氣泡的過程。

2 結(jié)果

2.1 FR-HCPT-PNPCA的制備與一般性質(zhì)檢測 成功制備出靶向載藥的FR-HCPT-PNPCA乳液，外觀與非靶向HCPT-PNPCA及靶向非相變FR-HCPT-NPCA乳劑無明顯差異，光鏡下納米粒形態(tài)呈折光的球形顆粒，分散性好，約8.9×109個/毫升(圖1)。激光粒度儀測得其粒徑為(525.48±65.73)nm，Zeta電位為(-18.52±2.86)mV。24 h后乳液出現(xiàn)明顯分層并沉積于容器底部，但輕搖后即可混勻恢復(fù)乳液外觀，且光鏡下觀察納米粒的形態(tài)、大小均無明顯變化。

2.2 FR-HCPT-PNPCA藥物包封率和載藥量的測定 采用高效液相色譜法檢測獲得10-HCPT樣品色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=128.63X-29.40，決定系數(shù)(R2)=0.996 6，將測得的色譜圖中曲線下面積(即Y值)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算獲得樣品中溶液濃度值(即X值)，將X值分別代入包封率和載藥量計算公式，獲得樣品包封率為70.42%，載藥量為20.05%。

2.3 FR-HCPT-PNPCA體外尋靶能力 靶向組加入FR-HCPT-PNPCA孵育后，大量的綠色熒光納米粒與染成紅色的肝癌細胞特異性結(jié)合，以細胞壁游離面顯著；而非靶向組加入HCPT-PNPCA后，則幾乎無納米粒與肝癌細胞黏附結(jié)合(圖2)。

2.4 FR-HCPT-PNPCA的體外相變能力 光鏡下動態(tài)錄像觀察，當(dāng)溫度加熱至70℃后，加入相變型的FR-HCPT-PNPCA納米粒乳液玻片，部分納米粒體積迅速由小變大并產(chǎn)生微氣泡，隨著溫度升高及時間的延長，微氣泡的體積也逐漸增大甚至破裂，且可見更多納米粒發(fā)生相變產(chǎn)生微泡，直至載玻片上的液滴變干。而加入非相變型的FR-HCPT-NPCA玻片上則幾乎未見到微泡的產(chǎn)生(圖3)。

3 討論

化療一直是治療惡性腫瘤的重要手段，但其存在全身傷害大、用藥劑量大的問題?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)強調(diào)對疾病的精準(zhǔn)醫(yī)療[4]，而針對腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的關(guān)鍵之一在于對腫瘤的及早發(fā)現(xiàn)，并采取合適的治療。分子影像學(xué)的發(fā)展，有可能從分子水平診斷腫瘤，為實現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療提供有力保障。隨著超聲分子影像學(xué)的誕生，利用超聲微泡和超聲固有的空化作用實現(xiàn)精準(zhǔn)藥物控釋成為當(dāng)今研究的熱點[5-6]，但普通載藥超聲微泡存在一些不足，如粒徑大、存留時間短、靶向性能差、性質(zhì)不穩(wěn)定、載藥能力不高等。

超聲分子探針的研發(fā)很大程度上決定了超聲分子影像學(xué)前進的步伐。理想的超聲分子需具備以下幾個特點：①粒徑足夠小；目前認(rèn)為，腫瘤組織血管內(nèi)皮間隙可達780 nm[7]，粒徑小于此數(shù)值的納米粒，有可能通過血管內(nèi)皮間隙到達腫瘤組織間隙；傳統(tǒng)的超聲微泡，粒徑一般在微米級，所以只能作為一種血池顯影劑在血管內(nèi)顯影，不能與腫瘤細胞“零距離”接觸，達到靶向分子顯影和治療腫瘤的目的。此外，血管內(nèi)的超聲微泡很容易隨血液循環(huán)被帶走或清除，持續(xù)時間短；本研究通過簡單的雙步乳化的工藝成功制備出一種靶向載藥的納米粒FR-HCPT-PNPCA，其粒徑約500 nm，可能通過內(nèi)皮間隙在腫瘤細胞周圍聚集；②可增強超聲顯影；超聲造影主要采集微泡在超聲作用下共振產(chǎn)生的二次諧波信號，因此，超聲微泡的應(yīng)用使得超聲造影技術(shù)飛速發(fā)展。因此，超聲分子探針需粒徑在納米級的氣泡，但納米微泡產(chǎn)生的諧波信號多不盡如人意，加上納米微泡制作工藝復(fù)雜，使超聲分子探針的研究面臨瓶頸；為此，有學(xué)者[2,8]采用納米液滴相變的方法解決粒徑(納泡)和顯影(微泡)的矛盾；采用生物相容性好的液態(tài)氟碳為核心，以脂質(zhì)、硅殼、白蛋白或高分子材料為殼膜材料等制備納米粒，經(jīng)注射后可通過血管內(nèi)皮間隙，且此納米粒在一定頻率、峰值負壓的超聲作用下，可在原位相變產(chǎn)生微泡，達到增強超聲顯影的目的。本實驗中采用的PFH[2]，其沸點約56℃，介于全氟戊烷(PFP，29℃)和全氟辛溴烷(PFOB，146℃)之間，制備的納米粒在加熱到70℃后，可發(fā)生明顯的相變并產(chǎn)生微泡，從而增強超聲顯影；③靶向性能好；要實現(xiàn)超聲分子探針的靶向性能，必須選取合適的靶點。目前，較多的腫瘤靶向手段集中在腫瘤血管內(nèi)皮細胞異常表達的物質(zhì)，如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)及受體、整合素αvβ3、細胞間黏附分子ICAM-1等，還不能真正地靶向腫瘤細胞。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，葉酸受體在大部分惡性腫瘤組織，如卵巢癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌組織中高度表達，且葉酸受體表達水平越高，腫瘤細胞分化越差，而在正常組織中幾乎不表達。葉酸是天然存在的小分子物質(zhì)，無免疫原性，因此，將葉酸用作靶向修飾配體，可特異性地與細胞表面的葉酸受體結(jié)合，在腫瘤的診斷、靶向藥物、基因治療等多方面有良好的應(yīng)用前景。本研究中制備FR-HCPT-PNPCA用到的殼膜材料含有耦聯(lián)葉酸的磷脂，在體外實驗中，可較好地靶向肝癌細胞。

圖1 FR-HCPT-PNPCA納米粒光鏡圖(×1 000) 納米粒形態(tài)規(guī)則，分布均勻 圖2 FR-HCPT-PNPCA相變圖(×1 000) 加入納米粒孵育后于激光共聚焦顯微鏡下觀察，非靶向組肝癌細胞(紅色)周圍未見納米粒黏附(A)，而靶向組可見到大量綠色熒光的納米粒聚集黏附在肝癌細胞表面(B) 圖3 FR-HCPT-PNPCA相變圖(×400) 隨著溫度增加至70℃，相變組(A)可見明顯的納米粒相變，隨微氣泡的產(chǎn)生和增大，普通非相變組(B)則未見相變和氣泡的產(chǎn)生

對于腫瘤治療，藥物化療仍然是不可或缺的手段。腫瘤靶向給藥系統(tǒng)(targeted drug delivery system， TDDS)通過某些特殊載體將化療藥物定向輸送至靶組織，并局部釋放藥物作用于腫瘤細胞，而不影響非靶區(qū)的正常細胞功能，從而提高療效、減少全身毒副作用[5]。將化療藥物如紫杉醇在制備過程中包載于殼膜，利用超聲靶向破壞微泡(ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)技術(shù)控制藥物釋放，被認(rèn)為是一種非常有前景的控釋藥物的方法。但由于載體的空間有限，其載藥量較低，無法滿足臨床所需的劑量。羥基喜樹堿是目前治療多種惡性腫瘤療效較好的化療藥物，相比于其他抗腫瘤藥物，其所需藥物劑量低(4～6 mg/d)[6，10-11]，可彌補脂質(zhì)超聲微泡自身載藥量有限的缺陷，在利用UTMD技術(shù)治療中更具優(yōu)勢。本研究制備的包載10-HCPT的納米粒，具有較高的包封率(70.42%)和載藥量(20.05%)，可達到腫瘤治療劑量。

本研究綜合各種超聲分子探針的優(yōu)勢，成功制備出一種葉酸受體靶向、包載化療藥物10-HCPT、具有相變能力的納米粒FR-HCPT-PNPCA乳液，有望成為一種多功能的超聲分子探針。本課題組將進一步進行該分子探針的體內(nèi)相變顯影和體內(nèi)外釋藥實驗，以及治療裸鼠肝癌移植瘤的研究，為進入臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Preparation and characteristics of 10-hydroxycamptothecin loaded folate-receptor targeted phase-change contrast agent

LIYouwei1,ZHOUWei2,ZHOUYang2*,YEMing2,ZHOUHong2

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,thePeople'sHospitalofDeyang,Deyang618000,China;2.DepartmentofUltrasound,theSecondAffiliatedClinicalHospitalofChongqinngMedicalUniversity,theThirdPeople'sHospitalofChengdu,Chengdu600031,China)

Objective To prepare a 10-hydroxycamptothecin (10-HCPT) loaded folate-receptor targeted phase-change contrast agent (FR-HCPT-PNPCA), and to study the general characteristics including drug loading, phase changing and targeting capability in vitro. Methods Using a method of two-step emulsification, the phase-change nanoparticles loading anticancer drug (10-HCPT) with lipids shell and liquid pefluorocarbon core were prepared. The entrapment efficiency and the drug-loading amounts were studied by high performance liquid chromatography, and the phase transition of the nanoparticles after heating was observed. The targeting ability was evaluated on liver cancer cell line 7721 in vitro. Results The FR-HCPT-PNPCA, with a drug encapsulation rate of about 70.42% and drug loading amounts of about 20.05%, was prepared successfully. When being heated to 70℃, obvious phase changing and microbubbles generating could be observed under microscope. In addition, a large amount of FR-HCPT-PNPCA particles could adhere specifically around the 7721 cells. Conclusion The prepared FR-HCPT-PNPCA, which has a stable characteristic and high performance of drug loading and tumor targeting, is expected to become a promising multifunctional molecular ultrasound probe for diagnosis and treatment of tumor.

10-hydroxycamptothecin; Folate; Target; Phase change; Contrast media

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81401433)、四川省衛(wèi)計委科研項目(130416)。

李友偉(1973—)，男，四川廣安人，碩士，副主任醫(yī)師。研究方向：肝癌的多學(xué)科診治。E-mail： 2729044075@qq.com

周洋，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院，成都市第三人民醫(yī)院超聲科，600031。E-mail： hansenzy@126.com

2016-10-17

2017-01-11

R445.1; R-332

A

1672-8475(2017)03-0169-04

10.13929/j.1672-8475.201610017