高鵬驥，陳雷，高杰，李照，王福順，冷希圣，朱繼業(yè)

（北京大學(xué)人民醫(yī)院 肝膽外科/北京市肝硬化肝癌基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害患者的生命健康。盡管已經(jīng)病毒性肝炎、酒精性肝病等HCC的高危因素已經(jīng)明確[1-4]，但是具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，早期診斷的臨床生物標(biāo)記物也有待進(jìn)一步發(fā)掘。近年來，非編碼RNA領(lǐng)域的進(jìn)展為HCC的研究帶來了新的希望，研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA和微小RNA均在HCC與癌旁組織中存在差異表達(dá)，可能與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)[5-6]。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是新近確認(rèn)的一類特殊的非編碼RNA分子，通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7-10]。文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道circRNA在結(jié)腸癌中存在特異性差異表達(dá)和基因調(diào)控功能，Li等[12-13]對胃癌和癌旁非腫瘤組織的研究發(fā)現(xiàn)，hsacirc002059在胃癌中的表達(dá)顯著下調(diào)，有望成為診斷胃癌的標(biāo)記物。circRNA是否在HCC中發(fā)揮作用，目前尚不明確。對其進(jìn)行深入研究有可能為闡明HCC的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)可用于早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物取得突破。

本研究預(yù)期篩選出HCC中差異表達(dá)的circRNA，為HCC的早期診斷和治療提供新的思路。

1　材料與方法

1.1　標(biāo)本收集

3例HCC和對應(yīng)的癌旁組織來源于2015年9月在北京大學(xué)人民醫(yī)院接受肝癌切除手術(shù)的患者?；颊叩腡NM分期均為I期，病灶為實(shí)性，最大徑線分別為2.7、3.5、6.7cm。標(biāo)本離體后10 min內(nèi)取材，以生理鹽水沖洗后裝入凍存管投入液氮罐冷藏，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存至提取總RNA。HCC和癌旁組織均經(jīng)病理證實(shí)。

1.2　circRNA芯片實(shí)驗(yàn)操作流程

總RNA提?。喝?00 mg標(biāo)本，應(yīng)用RNA抽提試劑TRIzol（Invitrogen公司）按照試劑說明分別從HCC組織和癌旁肝組織提取總RNA，應(yīng)用NanoDrop ND1000進(jìn)行純度和濃度測定；RNA標(biāo)記：應(yīng)用RNase R（Epicentre公司）處理總RNA，去除線性RNA，富集circRNA，應(yīng)用隨機(jī)引物按照Arraystar Supper RNA Labeling Protocol對circRNA進(jìn)行擴(kuò)增并轉(zhuǎn)錄為熒光cRNA；芯片雜交：將熒光標(biāo)記的cRNA應(yīng)用RNA提取試劑盒（Qiagen公司）純化后在circRNA芯片（8×15 K，Arraystar公司）上雜交，于分子雜交儀（Agilent公司）65 ℃孵育17 h；芯片掃描：雜交后的芯片洗片后，應(yīng)用Agilent Scanner G2505C掃描。

1.3　數(shù)據(jù)采集與分析流程

原始數(shù)據(jù)提?。簩⑿酒瑨呙鑸D片導(dǎo)入Agilent Feature Extraction軟件（版本11.0.1.1）提取原始數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)分析：應(yīng)用R軟件包對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并進(jìn)行分析，兩組樣本間差異表達(dá)的circRNA通過變化倍數(shù)進(jìn)行篩選，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4　生物信息學(xué)分析

根據(jù)差異表達(dá)變化倍數(shù)篩選circRNA，應(yīng)用Arraystar的miRNA目標(biāo)預(yù)測軟件（一款基于TargetScan[14]和miRanda[15]的軟件）預(yù)測與之相互作用的miRNA，文獻(xiàn)檢索已經(jīng)證實(shí)的在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用的miRNA，初步確定在HCC中具有重要作用的circRNA。

2　結(jié) 果

2.1　識別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)的circRNA

與癌旁肝組織比較，HCC組織中的circRNA表達(dá)譜發(fā)生了明顯變化（圖1）。圖1左側(cè)/右側(cè)紅點(diǎn)分別表示在HCC中表達(dá)下調(diào)/上調(diào)的滿足差異倍數(shù)1.5倍以上且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的circRNA。

圖1　circRNA火山圖Figure 1 Volcano plot of circRNAs

2.2　聚類分析circRNA表達(dá)譜的差異

繪制circRNA聚類圖，結(jié)果顯示在HCC和癌旁組織樣本間circRNA的表達(dá)譜存在差異（圖2）。

2.3　HCC中差異表達(dá)circRNA的篩選

將差異表達(dá)1.5倍以上且P＜0.05的circRNA確定為差異表達(dá)的circRNA。結(jié)果顯示HCC組織和癌旁組織相比，1.5倍以上變化的circRNA共82條，其中上調(diào)的共21條，下調(diào)的共61條；5倍以上變化的共3條，其中上調(diào)的2條，分別為hsacirc-0043278和hsa-circ-0006220，下調(diào)的1條為hsacirc-0065214。部分差異表達(dá)的circRNA見表1。

圖2　差異circRNA聚類圖Figure 2 Clustering plot of the differentially expressed circRNAs

表1　部分差異表達(dá)的circRNATable 1 Part of the differentially expressed circRNAs

2.4　初步確定可能在HCC中具有重要作用的circRNA

應(yīng)用Arraystar的miRNA目標(biāo)預(yù)測軟件對差異表達(dá)變化倍數(shù)較高的circRNA進(jìn)行分析，得到可能與之相互作用的miRNA（表2）。通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-520d-3p在胃癌和HCC組織中低表達(dá)，并與腫瘤惡性程度和化療敏感性有關(guān)。

表2　應(yīng)用Arraystar預(yù)測的可能與circRNA相互作用的miRNATable 2 The miRNAs that possiblly interacted with circRNAs predicted by Arraystar software

3　討 論

circRNA是一類特殊的非編碼RNA分子，大量存在于真核細(xì)胞，具有一定的組織、時(shí)序和疾病特異性[16-18]。circRNA又被稱為miRNA海綿，含有miRNA的多個串聯(lián)結(jié)合位點(diǎn)，通過競爭性結(jié)合miRNA來調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展[19-20]。研究[21-22]顯示，circRNA有望作為生物標(biāo)記用于腫瘤的診斷和治療。circRNA在HCC中的研究尚處于初級階段，本研究結(jié)合芯片技術(shù)及生物信息學(xué)分析，希望在HCC組織中發(fā)現(xiàn)circRNA的差異表達(dá)，為HCC的診斷和治療提供新的思路。

本研究中采用的circRNA芯片為Arraystar公司推出的全球首款circRNA芯片，采用特異性剪接位點(diǎn)探針與外切酶預(yù)處理雙重保障，能夠準(zhǔn)確檢測樣本中circRNA的表達(dá)。借助芯片對HCC和癌旁組織提取的RNA進(jìn)行分析，獲得了HCC和癌旁組織中的circRNA表達(dá)譜。按照差異表達(dá)倍數(shù)≥1.5且P＜0.05進(jìn)行篩選，獲得了82條差異表達(dá)的circRNA。其中上調(diào)的共21條，下調(diào)的共61條；5倍以上變化的共3條，其中上調(diào)的2條，下調(diào)的1條。在HCC組織中有circRNA的明顯上調(diào)和下調(diào)，提示這些circRNA可能參與了HCC的發(fā)生、發(fā)展及分子調(diào)控過程。

對82條具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，有3條circRNA差異表達(dá)倍數(shù)較高，且在3對樣本中具有較好的一致性。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測出這3條circRNA可能結(jié)合的miRNA后，通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，已有研究證實(shí)與hsa-circ-0043278和hsa-circ-0006220存在結(jié)合位點(diǎn)的hsa-miR-520d-3p在胃癌和HCC的發(fā)生發(fā)展過程中具有調(diào)控作用[23-25]。研究顯示，hsa-miR-520d-3p能夠抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，hsa-miR-520d-3p水平下調(diào)將導(dǎo)致不良預(yù)后。因此，初步確定hsa-circ-0043278和hsa-circ-0006220可能在HCC中具有重要作用。

本研究的局限性在于僅選取了3對樣本進(jìn)行分析，數(shù)量相對較少，存在一定的偶然性；實(shí)驗(yàn)采用的芯片為Human Circlar RNA Array V1.0，有許多新近發(fā)現(xiàn)的circRNA未納入；通過生物信息學(xué)預(yù)測和文獻(xiàn)檢索確定的hsa-circ-0043278和hsacirc-0006220尚未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。下一步將增加樣本量進(jìn)行芯片雜交分析，對初步確定的circRNA進(jìn)行qRTPCR驗(yàn)證，構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞，進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。

[1] Wanich N, Vilaichone RK, Chotivitayatarakorn P, et al. High prevalence of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis B infection in Thailand[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2016,17(6):2857–2860.

[2] Joshi K, Kohli A, Manch R, et al. Alcoholic liver disease: high risk or low risk for developing hepatocellular carcinoma?[J]. Clin Liver Dis, 2016, 20(3):563–580. doi: 10.1016/j.cld.2016.02.012.

[3] Minuk GY, Bautista W, Klein J. Evidence of hepatitis B virus infection in cancer and noncancer stem cells associated with human hepatocellular carcinoma[J]. Can J Infect Dis Med Microbiol, 2016,2016:8931591. doi: 10.1155/2016/8931591.

[4] 付囡, 陳茂偉. 丙型肝炎病毒致癌機(jī)制及其防治研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2014, 20(24):4504–4506. doi :10.3969/j.issn.1006–2084.2014.24.035.Fu N, Chan MW. Research Progress on the Carcinogenesis Mechanism of Hepatitis C Virus and Its Prevention[J].Medical Recapitulate, 2014, 20(24):4504–4506. doi :10.3969/j.issn.1006–2084.2014.24.035.

[5] 張立, 張迪, 李孝彬, 等. microRNA-616在肝癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國普通外科雜志, 2016, 25(7):991–997. doi :10.3978/j.issn.1005–6947.2016.07.010.Zhang L, Zhang D, Li XB, et al. Expression of microRNA-616 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2016, 25(7):991–997. doi :10.3978/j.issn.1005–6947.2016.07.010.

[6] 姚凱, 張光軍, 黃忠明, 等. 長鏈非編碼RNA MALAT1在肝癌中表達(dá)及功能研究[J]. 中國普通外科雜志, 2016, 25(1):90–96.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.01.014.Yao K, Zhang GJ, Huang ZM, et al. Long non-coding RNA MALAT1 expression in hepatocellular carcinoma and its action[J].Chinese Journal of General Surgery, 2016, 25(1):90–96.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.01.014.

[7] 劉彥, 周超. ciRS-7/miR-7軸調(diào)控腫瘤生長轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J]. 中國普通外科雜志, 2015, 24(7):1027–1031. doi: 10.3978/j.issn.1005–6947.2015.07.020.Liu Y, Zhou C. Regulative role of ciRS-7/miR-7 axis in tumor growth and metastasis: recent advances[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2015, 24(7):1027–1031. doi: 10.3978/j.issn.1005–6947.2015.07.020.

[8] Salzman J. Circular RNA expression: Its potential regulation and function[J]. Trends Genet, 2016, 32(5):309–316. doi: 10.1016/j.tig.2016.03.002.

[9] Xuan L, Qu L, Zhou H, et al. Circular RNA: a novel biomarker for progressive laryngealcancer[J]. Am J Transl Res, 2016, 8(2):932–939.

[10] Ahmed I, Karedath T, Andrews SS, et al. Altered expression pattern of circular RNAs in primary and metastatic sites of epithelial ovarian carcinoma[J]. Oncotarget, 2016, 7(24):36366–36381. doi:10.18632/oncotarget.8917.

[11] Wang X, Zhang Y, Huang L, et al. Decreased expression of hsacirc-001988 in colorectal cancer and its clinical significances[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(12):16020–16025.

[12] Li P, Chen S, Chen H, et al. Using circular RNA as a novel type of biomarker in the screening of gastric cancer[J]. Clinica Chimica Acta, 2015, 444:132–136. doi: 10.1016/j.cca.2015.02.018.

[13] Li Y, Zheng Q, Bao C, et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis[J]. Cell Res,2015, 25(8):981–984. doi: 10.1038/cr.2015.82.

[14] Enright AJ, John B, Gaul U, et al. MicroRNA targets in Drosophila[J]. Genome Biol, 2003, 5(1):R1.

[15] Pasquinelli AE. MicroRNAs and their targets: recognition,regulation and an emerging reciprocal relationship[J]. Nat Rev Genet, 2012, 13(4):271–282. doi: 10.1038/nrg3162.

[16] Danan M, Schwartz S, Edelheit S, et al. Transcriptome-wide discovery of circular RNAs in Archaea[J]. Nucleic Acids Res, 2012,40(7):3131–3142. doi: 10.1093/nar/gkr1009.

[17] Salzman J, Gawad C, Wang PL, et al. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types[J]. PLoS One, 2012, 7(2):e30733. doi: 10.1371/journal.pone.0030733.

[18] Cocquerelle C, Mascrez B, Hétuin D, et a1. Mis-splicing yields circular RNA molecules[J]. FASEB J, 1993, 7(1):155–160.

[19] Hentze MW, Preiss T. Circular RNAs: splicing's enigma variations[J]. EMBO J, 2013, 32(7):923–925. doi: 10.1038/emboj.2013.53.

[20] Hansen TB, Jensen TI, CIausen BH, et a1. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J]. Nature, 2013,495(7441):384–388. doi: 10.1038/nature11993.

[21] Qu S, Song W, Yang X, et al. Microarray expression profile of circular RNAs in human pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Genom Data, 2015 , 5:385–387. doi: 10.1016/j.gdata.2015.07.017.

[22] Qin ML, Liu G, Huo XS, et al. Has-circ-0001649: A circular RNA and potential novel biomarker for hepatocellular carcinoma[J].Cancer Biomarkers, 2016, 16(1):161–169. doi: 10.3233/CBM-150552.

[23] Li R, Yuan W, Mei W, et al. MicroRNA 520d-3p inhibits gastric cancer cell proliferation, migration, and invasion by downregulating EphA2 expression[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 396(1/2):295–305.doi: 10.1007/s11010–014-2164–6.

[24] Jiang H, Dong Q, Luo X, et al. The monoclonal antibody CH12 augments 5-fluorouracil-induced growth suppression of hepatocellular carcinoma xenografts expressing epidermal growth factor receptor variant III[J]. Cancer Lett, 2014, 342(1):113–120.doi: 10.1016/j.canlet.2013.08.038.

[25] Deshpande RP, Chandra Sekhar YB, Panigrahi M, et al. SIRP Alpha Protein Downregulates in Human Astrocytoma: Presumptive Involvement of Hsa-miR-520d-5p and Hsa-miR-520d-3p[J]. Mol Neurobiol, 2016. [Epub ahead of print]