劉偉偉，劉洪，余鋒，柏楊 ，李福利，羅昆侖,

（1． 安徽醫(yī)科大學無錫臨床學院 肝膽外科，江蘇 無錫 214044；2． 中國人民解放軍第一〇一醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 無錫214044）

肝切除仍是肝腫瘤最重要的治療方法[1-3]。然而，剩余肝體積（FLR)不足易引起肝功能異常限制了擴大肝切除術。擴大肝切除術后肝功能不足會引起一系列臨床癥狀，例如：術后肝衰竭（PHLF）和小肝綜合征（SFSS）。因此，手術成功的關鍵就在于術后剩余肝臟的體積和功能[4]。為了提高手術切除率，人們先后提出了幾個促進肝臟增生的策略，例如：上世紀80年代，Makuuchi等[5]首次將門靜脈栓塞（PVE）應用于需要大范圍肝切除的患者。PVE或門靜脈結扎（PVL）的應用使原來由于剩余肝臟不足而無法手術的患者有了手術的機會。但是PVE或PVL術后肝臟增生需要4～8周的時間才能達到標準，在這期間會造成腫瘤進展而且仍有部分患者會因肝臟增生不足而無法進行肝切除術[6-9]。

2007年德國學者[10]開展了一種新的術式——聯(lián)合肝臟分割和門靜脈結扎的二步肝切除術（ALPPS），隨即引起國內外肝膽外科醫(yī)生的廣泛關注[11-12]。ALPPS手術方法的出現(xiàn)解決了PVL或PVE的不足，與PVL或PVE相比ALPPS可以在很短時間內促進剩余肝臟快速增生[13]。但是同時有臨床報告[14-15]指出ALPPS術后有很高的并發(fā)癥率和病死率。目前ALPPS促進肝增生的機制仍不清楚，國內少有動物模型；本實驗建立通過對SD大鼠肝臟解剖的學習建立ALPPS動物模型，評價術后肝功能及肝再生情況，可為以后研究其機制、并發(fā)癥、死因等奠定良好的基礎。

1　材料與方法

1.1　實驗材料與設計

雄性SD大鼠，體質量200～240 g，由江蘇省血吸蟲病防治研究所提供，首先用20只SD大鼠進行大鼠肝臟解剖學習及ALPPS手術訓練；然后將60只SD大鼠隨機均分為PVL組、ALPPS組、假手術組。動物在控制溫度、濕度及12 h照明與12 h黑暗交替的環(huán)境中喂養(yǎng)，并允許隨時自由食用固定標準飼料飲食和清水。實驗大鼠實驗所用外科手術器械由中國人民解放軍第一〇一醫(yī)院提供；Ki-67抗體購自無錫傲銳東源生物有限公司。

1.2　手術方法

所有大鼠采用10%水合氯醛（3.0～3.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉；由正中縱切口入腹腔。PVL組在手術燈下仔細分離出供應肝右葉門靜脈支和供應左外葉及中葉左支的門靜脈支，分別用4-0絲線結扎，保留肝右中葉分支，將尾狀葉切除；ALPPS組除上述步驟外將大鼠肝臟左中葉和右中葉在缺血帶處離斷，注意缺血帶位于肝中葉中靜脈和肝左中葉門靜脈之間，離斷過程中勿傷及肝中葉中靜脈。離斷肝臟時采用血管鉗逐步壓榨，膈面的背膜用眼科剪分離，離斷過程中采用壓迫和4-0絲線結扎的方法止血，最后將止血海綿放入斷面以便止血和防止術后斷面粘連。假手術組僅游離出門靜脈分支，不做處理即關腹。被結扎部分約占全肝重量的70%，切除尾狀葉約占10%，術后仔細檢查無活動性出血，用3-0絲線關腹。定時觀察3組動物的生存情況。術后3組動物繼續(xù)飼養(yǎng)，并允許隨時自由食用固定標準飼料飲食和清水。

1.3　觀察指標

3組分別于術后1、2、4、7 d各取材5只，計算各時點大鼠右中葉肝再生率（hepatic regeneration rate，HRR）：HRR=（WA-WI）/WI×100%其中WA代表各時間點取標本時肝右中葉的質量（經過解剖12只體質量為200～240 g正常SD雄性大鼠，計算肝右中葉的質量WI約為體質量的0.68%）。抽取大鼠下腔靜脈血液4 mL，3 000 r/min 5 min分離血清-80 ℃保存，以備檢測各時點谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL）；留取左右肝中葉標本，10%甲醛固定，HE染色，觀察肝臟病理情況，計算肝左中葉組織壞死面積：在光學顯微鏡下（×100）隨即選取10個視野拍照留存，然后用Photoshop CS6計算每個照片內肝組織壞死面積，以壞死面積/整個視野面積×100%進行評分[16]。0分：無壞死；1分：壞死面積＜25%；2分：25%≤壞死面積＜50；3分：50%≤壞死面積＜75%；4分：壞死面積≥75%。免疫組織化學檢測各時點各組肝右中葉Ki-67水平，高倍視野內（×400）計算肝細胞數及Ki-67陽性細胞數，每張切片隨機選取5個視野，視野內Ki-67染色陽性細胞數的百分比即為Ki-67標記率。

1.4　統(tǒng)計學處理

2　結 果

2.1　手術訓練結果

經過20只大鼠的手術訓練，掌握了大鼠肝臟的解剖：大鼠肝臟中葉有左右2支門靜脈分支和左中右3支肝靜脈，選擇性PVL后，肝右中葉和左中葉之間出現(xiàn)缺血帶，此缺血帶位于肝中葉左靜脈和中靜脈之間，也位于肝中葉門靜脈左支和肝中靜脈之間，此間隙很窄，更困難是肝臟劈離時要剛好達到肝中靜脈，經過學習和實踐，筆者發(fā)現(xiàn)大概保持與下腔靜脈6 mm的距離可以避免傷及肝中靜脈而大量出血。手術分3步：⑴ 選擇性PVL；⑵ 尾狀葉的切除；⑶ 肝中葉的劈斷（圖1）。

圖1　ALPPS手術過程 A：進行肝右葉、左外葉、左中葉門靜脈結扎以及尾狀葉的切除；B：選擇性PVL后出現(xiàn)缺血帶；C：用蚊式鉗沿著缺血帶逐步進行肝臟劈離；D：劈離后的肝臟Figure 1 Surgical procedure of ALPPS A: Ligation of the portal vein branches for the left lateral, left middle, and right lobes of the liver and caudate lobe resection; B: Present of ischemic boundary after selective PVL; C: Liver transection along the ischemic boundary using mosquito clamp; D: Liver after transection

2.2　肝再生率結果分析

造模實驗中的大鼠均存活，無并發(fā)癥。PVL和ALPPS組各時間點右中葉HRR均明顯高于假手術組（均P＜0.05），在第4、7天ALPPS組右中葉HRR明顯高于PVL組，分別為（155.96±24.39）% vs.（118.15±9.77）%、（174.86±8.99）% vs.（133.55±16.48）%，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；第2天，ALPPS組肝再生率高于PVL組，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；第1天兩組肝再生率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖2）。

圖2　各組術后各時間點肝右中葉HRRFigure 2 HRR of each group at each postoperative time point after operation

圖3　各組各時間點肝功能指標檢測情況Figure 3 Liver function parameters in each group at each postoperative time point

2.3　肝功能檢測結果分析

在術后第1、2天ALPPS組和PVL組AST、ALT均明顯高于假手術組（均P＜0.05），第4、7天組間均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）；術后第1天ALPPS組AST、ALT比PVL組明顯升高，分別為（2033.40±358.88）U/L vs.（1343.40±230.75）U/L、（982.60±165.63）U/L vs.（410.80±130.08）U/L，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；余時間點未見明顯差別（均P＞0.05）；兩組肝功能都在第4天恢復。與假手術組比較，ALPPS組和PVL組的血ALB各時間點均較低（均P＜0.05），ALPPS組在第1、2天較PVL組低，分別為（26.18±2.34）g/L vs.（29.90±2.21）g/L、（25.26±2.37）g/L vs.（29.66±2.40）g/L（均P＜0.05）；術后第4，7天兩組差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；3組TBIL術后各時間點均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）（圖3）。

2.4　病理切片結果

HE染色切片觀察，假手術組肝左中葉無壞死，PVL組術后第1天肝左中葉壞死面積得分為1.6±0.70，而ALPPS組得分為3.5±0.71，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4　術后第1天肝左中葉壞死情況 A：HE染色（×100）；B：壞死面積比較Figure 4 Necrosis in left middle lobe of the liver on postoperative day 1 A: HE staining (×100); B: Compariosn of the necrosis areas

2.5　Ki-67檢測結果

與PVL組比較，ALPPS組Ki-67陽性率在第2、4天明顯較高，分別為（85.36±9.13）% vs.（61.84±10.14）%、（43.40±7.89）% vs.（29.06±6.38）%，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），余時間點均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），第7天Ki-67陽性率兩組均很低（圖5）。

圖5　右中葉Ki-67檢測 A：Ki-67免疫組化染色（×400）；B：ALPPS和PVL術后Ki-67陽性率變化Figure 5 Determination of Ki-67 in the right middle lobe of the liver A: Immunohistochemical staining for Ki-67 (×400); B: Changes in Ki-67 positive rates in ALPPS group and PVL group after operation

3　討 論

剩余肝臟體積不足是肝臟巨大腫瘤切除最重要的限制因素。對于正常的肝臟來說，剩余肝臟體積要達到25%以上可以維持代謝平衡，但對于肝功能不良和早期肝損傷的患者比例要達到40%以上[17]。PVE或PVL使肝切除術得到了進一步發(fā)展，肝腫瘤的切除范圍得到了擴大。但仍有一些患者出現(xiàn)剩余肝體積不足，PVE或PVL二步行肝切除術時由于時間過長腫瘤會進展。而ALPPS解決了以上問題，它可以在短時間內促進肝臟快速增生，Schnitzbauer等[10]報道術后平均9 d、而de Santiba?es等[13]報道術后第7天即實施了第二次大范圍肝切除術；從而避免了二次手術時腫瘤的進展?？墒茿LPPS臨床應用中出現(xiàn)較高的并發(fā)癥率和病死率[14-15]，且ALPPS肝臟增生的機制并不明確。肝膽外科醫(yī)生在臨床和基礎上不斷改進、探索，如繞肝提拉法聯(lián)合ALPPS的應用[18]，腹腔鏡下ALPPS的應用[19]。本實驗的目的是建立大鼠ALPPS模型，觀察術后肝功能變化及剩余肝再生情況，為研究ALPPS肝再生機制、術后并發(fā)癥及死亡原因奠定良好的基礎。選擇大鼠作為本研究模型有以下幾個原因：大鼠肝臟解剖和功能是以Couinaud描述的人類肝臟為基礎[20]，肝臟是高度可再生的且每葉的肝實質是相對恒定的[21]，可以選擇性結扎70%以上門靜脈血流從而最快促進肝再生。大鼠的肝右中葉約占大鼠總肝的20%[22]，這與臨床中PVL或ALPPS的需求相近[23-24]。本研究將大鼠肝臟尾狀葉切除，模仿經典肝部分切除，進一步促進肝再生。

本研究結果顯示，大鼠的肝中葉可模仿人體肝臟，有2支門靜脈和3支肝靜脈，經過選擇性門靜脈結扎后，缺血帶會出現(xiàn)在肝中葉左側和右側之間，也位于左中葉門靜脈和肝中葉中靜脈之間，實踐證明沿著此缺血帶劈離肝臟出血很少，有少量出血可采用壓迫和縫扎的方法止血，注意術中勿傷及肝中靜脈。與假手術組比較，ALPPS組、PVL組均有效促進了肝再生（均P＜0.05），但ALPPS組在術后第4、7天明顯比PVL組肝再生率高（均P＜0.05），術后第1、2天肝再生率差異不顯著。ALPPS和PVL可能有相同的促進肝再生的機制，但是ALPPS有更強的刺激因素；在第2天ALPPS組已有高于PVL的趨勢，分析這正在為肝臟快速增生做準備，此時肝臟增生不明顯，肝細胞的增殖需要時間。用免疫組化方法檢測Ki-67去驗證這一結果。Ki-67作為一種增殖細胞核相關抗原，與細胞有絲分裂密切相關，表達范圍覆蓋除G0期以外各增殖期細胞，可以較好的反應細胞處于增殖狀態(tài)[25-26]。免疫組化檢測ALPPS組Ki-67術后第2、4天明顯高于PVL組（均P＜0.05）；術后7 d的Ki-67表達很低，肝臟增生較少，達到穩(wěn)定狀態(tài)。

PVL和ALPPS都可促進肝再生，在1、2天無明顯差異，但在第4天肝再生率明顯增高，筆者推測：⑴ 可能與肝臟血流阻斷有關，肝臟劈離后，左中葉血流減少且萎縮壞死更加嚴重，肝臟丟失更多，從而刺激肝臟增生[22]；⑵ 肝中葉離斷引起引起炎癥反應，釋放炎癥因子（如IL-6、TNF-α等）刺激肝臟再生[27]。肝左中葉劈離后1天，病理顯示壞死面積明顯比ALPPS組大，血AST、ALT第1天也比PVL組高，這與劈離后左中葉壞死面積較大相符。ALB檢測也發(fā)現(xiàn)ALPPS組比PVL組低，這可能與肝損傷、應激、左中葉的壞死相關。這些因素有可能在一定程度上促進了肝臟再生；同時這些因素也可能是引起ALPPS并發(fā)癥和死亡率高的原因，這有待進一步實驗探討。

綜上所述，本實驗成功建立了大鼠ALPPS模型，驗證了其可在較短時間促進肝再生并探討了其可能增生機制。本實驗存在一定的缺陷：大鼠模型和人類有差別，實驗所用大鼠肝臟均是正常肝臟，肝腫瘤時一般會肝硬化或肝功能不良；但本實驗可以為進一步研究ALPPS肝再生的機制、相關并發(fā)癥、病死率以及肝硬化、肝腫瘤做基礎。

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