陶一明，胡寬，湯參娥，馮鐵誠，王志明

（中南大學湘雅醫(yī)院 1． 肝臟外科 2． 醫(yī)學科學研究中心，湖南 長沙 410008）

BTB/POZ結構域蛋白7（BTB/POZ domaincontaining protein 7，BTBD7）基因定位染色體14q32.12，是迄今發(fā)現(xiàn)的一個新的癌基因，具有調控腫瘤細胞發(fā)生上皮-間質轉化和腫瘤血管塑形的潛在重要功能，是肝細胞癌（HCC）新的上皮間質轉化和預后標志物[1]。BTBD7的假基因（pseudogene）1、2（BTBD7P1、BTBD7P2）分別定位染色體10p13和10q25，其序列與BTBD7呈高度同源性，為高度保守的非編碼序列，屬于長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[2]。近年來研究[3-4]表明，假基因和lncRNA在腫瘤中存在異常表達，并且在腫瘤發(fā)生過程中有重要的調控作用。筆者通過實時定量RT-PCR檢測HCC患者組織標本發(fā)現(xiàn)BTBD7P2在HCC組織中少見表達，BTBD7P1在HCC組織中表達水平顯著下調，通過其表達水平與HCC臨床病理特征及預后的相關性分析，BTBD7P1可能在HCC發(fā)生發(fā)展中起重要作用。通過構建BTBD7P1的慢病毒過表達載體，轉染HCC細胞系Bel7404，檢測轉染對細胞BTBD7 mRNA、蛋白水平以及細胞增殖的影響。旨在為研究發(fā)現(xiàn)HCC發(fā)生發(fā)展相關新基因提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　HCC組織標本

HCC組織樣本共106例，為2009—2010年間于中南大學湘雅醫(yī)院肝臟外科行手術切除的HCC患者，均已被告知并簽署書面知情同意書。本課題研究內容已報中南大學湘雅醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批備案，同意實施。HCC確診根據2010年版世界衛(wèi)生組織（WHO）病理診斷標準。

1.2　細胞系和細胞培養(yǎng)

HCC細胞系Bel7404購自美國保藏物中心（ATCC），生長于含體積分數為10%小牛血清、青霉素（10萬U/L）和鏈霉素（10萬U/L）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分數為5% CO2細胞培養(yǎng)箱孵育。

1.3　SYBR熒光染料法定量PCR

PCR引物堿基對序列采用美國哈佛大學引物數據庫Primer Bank（http://pga.mgh. harvard.edu/primer bank）在線設計，擴增產物約100～250 bp大小，經Blast程序比對確定引物的特異性后，由大連TaKaRa生物技術公司合成。取TRIzol?Reagent（美國Thermo公司）提取新鮮HCC組織總RNA，測定濃度后合成cDNA 用于PCR擴增，用△△Ct以來計量表示該樣本中目的基因的表達水平。反應體系和擴增條件參照文獻。目的基因序列見表1。

1.4　慢病毒載體pLKO.1-BTBD7P1過表達質粒構建

由上海吉凱生物技術公司完成，根據BTBD7P1基因序列，合成其基因過表達序列；重組病毒包裝、收集和病毒濃縮液滴度檢測具體方法參照文獻。得到病毒濃縮液，檢測滴度約為1×109TU/mL。分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1　定量PCR擴增基因序列Table 2 Oligonucleotide sequences of specific primers for quantitative real-time PCR

1.5　慢病毒質粒轉染Bel7404細胞

選擇Bel7404細胞為轉染靶細胞[1]。分為兩組：⑴ 轉染LV-BTBD7P1的Bel7404細胞組（Bel7404LV-BTBD7P1）；⑵ 轉染空載體的Bel7404細胞（Bel7404LV-Control）作為對照組。轉染條件和實驗操作步驟參照文獻[5]。

1.6　MTT法檢測Bel7404細胞增殖抑制率

Bel7404細胞轉染BTBD7P1過表達質粒和空載體后觀察細胞數目，實驗操作步驟參照文獻[1]。每個實驗重復3次取平均值。

1.7　Western blot檢測BTBD7的表達

胰酶消化離心轉染后的Bel7404細胞，4 ℃預冷的PBS洗滌，800 r/min，離心2次收集細胞，RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，檢測蛋白質濃度。電泳、轉膜、封閉液實驗操作步驟參照文獻。BTBD7抗體工作濃度為1:1 000。Bio-Rad Scan軟件計算條帶的灰度值和內參α-tubulin灰度值的作為蛋白表達量。每個實驗重復3次取平均值。

圖1　定量PCR檢測BTBD7P1與BTBD7P2的表達Figure 1 BTBD7P1 and BTBD7P2 expressions detected by real time PCR

1.8　統(tǒng)計學處理

2　結 果

2.1　HCC組織中BTBD7P1 mRNA表達水平下調

106例配對HCC組織中BTBD7P1 mRNA的表達水平明顯低于鄰近癌旁肝組織中的表達水平[（0.71±0.16） vs.（ 2.14±1.44），P＜0.05]；HCC組織及癌旁肝組織中少見BTBD7P2 mRNA表達（圖1）。

2.2　BTBD7P1表達與HCC臨床病理特征的關系

根據癌組織中BTBD7P1相對表達量低于癌旁肝組織2倍為標準分為低表達和高表達。BTBD7P1低表達與腫瘤大小、衛(wèi)星灶、分化程度、靜脈血管侵犯、出血壞死和HCC分期有關（均P＜0.05）（表2）。

2.3　BTBD7P1 mRNA表達與HCC預后的關系

本組BTBD7P1 mRNA高表達患者1、3、5年總體生存率分別為93%、74%、53%，BTBD7P1 mRNA低表達患者1、3、5年總體生存率分別為77%、44%、18%，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；BTBD7P1 mRNA高表達患者1、3、5年無瘤生存率分別為74%、57%、38%，BTBD7P1 mRNA低表達患者1、3、5年無瘤生存率分別為22%、12%、5%，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

表2　BTBD7P1 mRNA表達與HCC臨床病理特征相的關系[n（%）]Table 2 Relations of BTBD7P1 mRNA expression with clinicopathologic characteristics of HCC [n (%)]

圖2　不同BTBD7P1 mRNA表達水平患者生存情況比較 A：總體生存曲線；B：無瘤生存曲線Figure 2 Comparison of the survival conditions between patients with different BTBD7P1 mRNA expression levels A: Overall survival curves; B: Tumor-free survival curves

2.4　過表達BTBD7P1抑制HCC細胞增殖

活細胞計數檢測Bel7404細胞增殖的變化（圖3）。轉染LV-BTBD7P1的Bel7404細胞組（Bel7404LV-BTBD7P1）與對照組細胞（Bel7404LV-Control）比較，細胞數明顯減少（P＜0.05）。

2.5　BTBD7P1抑制HCC細胞的BTBD7 mRNA表達

通過RT-PCR方法檢測Bel7404LV-BTBD7P1和Bel7404LV-Control細胞中BTBD7 mRNA表達水平，結果顯示，Bel7404LV-BTBD7P1細胞中BTBD7 mRNA表達水平較Bel7404LV-Control細胞明顯下調（P＜0.05）（圖4）。通過Western blot檢測兩組細胞中BTBD7蛋白表達變化，結果顯示，兩組細胞BTBD7蛋白表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖5）。

圖3　MTT檢測結果Figure 3 Results of MTT assay

圖4　BTBD7 mRNA表達檢測Figure 4 Measurement of BTBD7 mRNA expression

圖5　BTBD7蛋白表達檢測Figure 5 Measurement of BTBD7 protein expression

3　討 論

HCC是我國常見惡性腫瘤之一。進一步探索研究新基因的功能與HCC發(fā)生發(fā)展的關系，對揭示HCC發(fā)生、發(fā)展的精確分子機制、設計合理的治療藥物及判斷預后，進一步提高我國HCC的治療水平具有重要意義。

BTBD7基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種上皮間質轉化調控關鍵基因，定位于人類染色體14q32.12區(qū)域，約1 233 bp大小，其結構中包括BTB/POZ結構域，CAAT增強蛋白β（C/EBP-β），GATA和AP-1轉錄子位點[6]。BTBD7首次被發(fā)現(xiàn)是因其可引導上皮細胞發(fā)生“分支形態(tài)”（branching morphogenesis）改變過程中發(fā)揮了重要作用[7]。已有的研究[8]顯示，BTBD7基因也稱FUP1，最先是從肝臟細胞中克隆發(fā)現(xiàn)被鑒定，其在肝臟組織表達有相對特異性，并被證實在HCC細胞系中表達上調。筆者[1]前期研究中證實：BTBD7表達誘導HCC細胞發(fā)生上皮間質轉化表型，并激活下游RhoC-ROCK2-FAK通路信號，促使HCC細胞分泌較多的基質金屬蛋白酶2/9（MMP-2/9）。目前調控BTBD7表達研究鮮見報道。

新近研究[9]表明，假基因異常表達可能在腫瘤發(fā)生中起重要作用。部分假基因對其功能基因有調節(jié)作用[10]。而且特異性假基因表達可作為腫瘤的預測因子，諸如AOC4P[11]、OCT4[12]、INTS6P1[13]等。目前關于BTBD7假基因（BTBD7P1和BTBD7P2）在HCC及其他惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展關系未見報道。本研究結果顯示，在HCC患者組織中的BTBD7P1表達水平顯著低于癌旁組織，臨床病理相關性分析發(fā)現(xiàn)BTBD7P1低表達水平與HCC的侵襲轉移及預后密切相關，提示BTBD7P1的表達水平與HCC的發(fā)生可能存在一定關系。目前BTBD7P1在HCC表達下調的原因尚不清楚，可能涉及缺氧微環(huán)境的調節(jié)[14]或表觀遺傳調控機制[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)BTBD7P1可抑制親本基因BTBD7 mRNA的表達，但對BTBD7蛋白表達無影響，提示BTBD7P1可能扮演了內源性小RNA（esiRNA）[16]或內源性競爭環(huán)狀RNA（ceRNA）重要角色[17]。BTBD7P1具有與親本功能基因BTBD7編碼的蛋白質一樣的功能，即抑制HCC細胞生長。說明BTBD7P1不需要通過BTBD7蛋白發(fā)揮作用，但具體調控機理尚有待進一步探索。已有研究證據表明，假基因可通過競爭性地結合miRNA調控功能基因的表達，從而抑制或者促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。提示上述作用分子機制可能是BTBD7 mRNA及BTBD7P1轉錄產物競爭某同一種或幾種microRNA，激活不同信號通路發(fā)揮功能得以實現(xiàn)，其中哪些是起決定性因素的microRNA調節(jié)或者可能參與的信號途徑值得進一步深入研究[19-20]。

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