陳曦 嚴(yán)茂祥 蔡月琴 葉蕾 陳芝蕓

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

Notch3/Hes1在沙鼠非酒精性脂肪性肝纖維化形成中的變化

陳曦 嚴(yán)茂祥 蔡月琴 葉蕾 陳芝蕓

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

[目的]研究沙鼠非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）進(jìn)展過程中Notch3/Hes1表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，探討其在脂肪性肝纖維化形成中的作用。[方法]長(zhǎng)爪沙鼠48只，隨機(jī)分為正常組和模型組，每組24只，正常組以普通飼料喂養(yǎng)，模型組以高脂飼料喂養(yǎng)，兩組分別于實(shí)驗(yàn)第4、8、16周末各處理沙鼠8只，HE和Masson染色光鏡觀察肝組織病理，組織芯片免疫組化法檢測(cè)肝組織Notch3、Hes1、α-SMA表達(dá)。[結(jié)果]和正常組比較,隨著高脂飲食時(shí)間增加，模型組沙鼠肝組織逐漸出現(xiàn)脂肪變、炎癥、纖維化甚至是肝硬化；正常組沙鼠肝組織僅少量Notch3、Hes1、α-SMA表達(dá)，模型組沙鼠肝組織Notch3、Hes1、α-SMA表達(dá)與同期正常組相比表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05、P＜0.01），第8周、16周時(shí)較第4周模型組增加明顯（P＜0.05、P＜0.01）；Notch3、Hes1蛋白表達(dá)水平與α-SMA蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯正相關(guān)（r=0.873和0.786，P＜0.01）。[結(jié)論]Notch/Hes信號(hào)在沙鼠非酒精性脂肪性纖維化形成中活性增強(qiáng)，可能參與高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝纖維化的形成。

NAFLD；肝星狀細(xì)胞；纖維化；Notch信號(hào)通路；組織芯片

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是目前臨床上最常見的肝病之一，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝纖維化等[1]。單純性脂肪肝預(yù)后良好，而脂肪性肝炎、肝纖維化則可能演變成肝硬化和肝癌。導(dǎo)致單純性脂肪肝進(jìn)展為脂肪性肝炎、肝纖維化的機(jī)制目前仍末明了，探討NAFLD的發(fā)病機(jī)制，尤其是闡明脂肪性肝炎和肝纖維化發(fā)生的潛在機(jī)制并阻斷其進(jìn)展對(duì)該病的防治具有重要的意義。研究表明，肝損傷-炎癥-修復(fù)過程導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化，促使α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）顯著增加，引起細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM)的合成與降解失調(diào)，是肝纖維化形成的關(guān)鍵[2-3]。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中，多條信號(hào)通路被激活，Notch通路是其中重要的一條，參與肝內(nèi)膽汁淤積性肝纖維化、慢乙肝肝纖維化、CCl4肝纖維化等的發(fā)生發(fā)展[4-6]；但其是否參與非酒精性脂肪性肝纖維化的形成目前未見報(bào)道。項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂可誘導(dǎo)沙鼠形成明顯的肝纖維化，其病理生理過程與人類NAFLD相似[7]，本實(shí)驗(yàn)觀察高脂誘導(dǎo)的沙鼠非酒精性脂肪性肝纖維化形成過程中Notch3/Hes1表達(dá)的變化，探討Notch通路在非酒精性脂肪性肝纖維化形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Z:ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠48只，體質(zhì)量(50±100)g，清潔級(jí)，購(gòu)自浙江省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障環(huán)境中，合格證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 膽固醇購(gòu)于上海伯奧生物有限公司，批號(hào)：131101；3號(hào)膽鹽購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司，批號(hào)：20140121。高脂飼料（由3號(hào)膽鹽、膽固醇、豬油、蛋黃粉及普通飼料按1：4：14：20：161比例配制）及普通飼料均浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制備。蘇木素購(gòu)于sigma進(jìn)口分裝，批號(hào)：2101621；伊紅購(gòu)于上海三愛式劑有限公司，批號(hào)：20100808；Masson染色試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20131217；Notch3多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)SantaCruz公司，批號(hào)：H1308；Hes1單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)SantaCruz公司，批號(hào)：F1406；α-SMA多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：201411；Envision免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)于丹麥DAKO公司，批號(hào)：14J2677A。

1.3 主要儀器 MICROM STR120組織脫水機(jī)（德國(guó)MICROM公司），MICROM HM335E石臘包埋機(jī)（德國(guó)MICROM），LeicaRM 2025病理切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），組織芯片制備儀TM－1（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），Leica DMLB2顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1.4 分組及處理 沙鼠隨機(jī)分為正常組及模型組2組，每組24只，正常組喂養(yǎng)普通飼料，模型組喂養(yǎng)高脂飼料，自由飲水及進(jìn)食，每組分別于實(shí)驗(yàn)第4、8、16周末處理沙鼠8只；沙鼠處理前晚起禁食不禁水18h，次日空腹麻醉下處死，收集肝組織，于10%中性福爾馬林中固定，常規(guī)制備成蠟塊待用。

1.5 肝組織病理診斷 采用HE和Masson染色光鏡觀察，參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組“非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）”[8]進(jìn)行肝組織脂肪變、炎癥程度及纖維化程度診斷。

1.6 組織芯片制備 肝組織蠟塊常規(guī)切片HE染色，顯微鏡下確定目標(biāo)區(qū)并在臘塊上做定位標(biāo)記；采用半自動(dòng)打孔陣列儀根據(jù)標(biāo)本數(shù)量在受體蠟塊上打孔，并精確排成微孔陣列；在標(biāo)記蠟塊上鉆取定位的組織柱，按設(shè)計(jì)方案移到受體蠟塊上；將設(shè)計(jì)好的蠟塊放入溫箱，調(diào)定溫箱溫度，半融狀態(tài)下取出，室溫冷卻后放入4℃冰箱中備用；借助輔助切片膠帶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)對(duì)組織芯片蠟塊進(jìn)行連續(xù)常規(guī)切片，切片厚度2～3μm。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用Envision法檢測(cè)肝組織芯片Notch3、Hes1、α-SMA表達(dá)。組織芯片切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗（Notch3工作濃度1:100、Hes1工作濃度1:100、α-SMA工作濃度1:200）4℃孵育過夜，Envision二抗室溫孵育45min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后封片。結(jié)果評(píng)判如下，陽(yáng)性細(xì)胞光鏡下呈均勻棕黃色細(xì)顆粒狀，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的著色程度與著色范圍進(jìn)行半定量積分：著色強(qiáng)度即無色0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分；著色范圍即無陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜1%為1分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在1%～10%之間為2分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在10%～50%之間為3分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%為4分；著色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積即為該蛋白的表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析統(tǒng)計(jì)，積分以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組之間比較采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理 HE和Masson染色顯示，正常組沙鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常；模型組沙鼠肝組織出現(xiàn)明顯的脂肪變、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原間隔形成，4周時(shí)以肝細(xì)胞脂肪變?yōu)橹?，少量小葉內(nèi)點(diǎn)狀壞死灶；8周時(shí)脂肪變、小葉內(nèi)壞死灶、肝細(xì)胞氣球樣變?yōu)橹?，竇周少量膠原纖維沉積；16周時(shí)除脂肪變、小葉內(nèi)壞死灶和肝細(xì)胞氣球樣變外，間質(zhì)纖維沉積明顯增多，膠原間隔形成。

2.2 肝組織Notch3、Hes1、α-SMA表達(dá) 沙鼠肝組織 Notch3、Hes1、α-SMA蛋白表達(dá)以細(xì)胞胞質(zhì)為主，著色均為棕黃色。正常組沙鼠肝組織僅少量Notch3、Hes1、α-SMA表達(dá)，模型組沙鼠肝組織Notch3、Hes1、α-SMA均明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），且隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間增加而表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。相關(guān)性分析顯示Notch3、Hes1蛋白表達(dá)水平與α-SMA蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯正相關(guān)（r=0.873和0.786，P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 NAFLD沙鼠肝組織Notch3、Hes1、α-SMA動(dòng)態(tài)變化（±s，n=8）Tab.1 Dynamic changes of Notch3,Hes1 and α-SMA in liver tissue of gerbils（±s，n=8）

表1 NAFLD沙鼠肝組織Notch3、Hes1、α-SMA動(dòng)態(tài)變化（±s，n=8）Tab.1 Dynamic changes of Notch3,Hes1 and α-SMA in liver tissue of gerbils（±s，n=8）

注：與同期正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與4周模型組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。Note:*P＜0.05，**P＜0.01 compared with the normal group at the same time point;ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 compared with the model group at 4 weeks.

分組 Notch3 Hes1 α-SMA 4周8周16周正常組模型組正常組模型組正常組模型組1.37±0.52 4.75±1.03**1.25±0.71 7.75±2.82**Δ1.62±1.06 11.25±1.38**ΔΔ1.12±0.64 4.12±1.36**1.37±0.52 6.62±2.13**Δ1.25±0.46 10.12±2.23**ΔΔ1.00±0.76 3.62±0.74**1.12±0.64 6.25±2.19*Δ1.25±0.71 9.00±2.27**ΔΔ

圖1 沙鼠肝組織Notch3、Hes1、α-SMA表達(dá)（免疫組化,400×）Fig.1 The expression of Notch3,Hes1 and α-SMA in liver tissue of gerbils(immunehistochemical,400×)

3 討論

Notch信號(hào)通路由Notch受體、配體、DNA結(jié)合蛋白及下游分子等構(gòu)成，在進(jìn)化上高度保守。哺乳動(dòng)物發(fā)現(xiàn)有4種Notch受體，即Notch1-4，這些受體通過與配體的相互作用轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)，啟動(dòng)下游基因如Hes(Hesl、Hes5)家族等堿性螺旋環(huán)家族蛋白的表達(dá)，從而在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)異常的Notch信號(hào)通路與肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)：Notch3在病變的肝組織中表達(dá)上調(diào)[11]。在HSC的培養(yǎng)過程中，隨著HSC成長(zhǎng)為肌成纖維細(xì)胞，Notch信號(hào)通路激活，其受體及配體表達(dá)活躍，反之抑制Notch信號(hào)則肝纖維化程度降低[12-13]。 Notch還可與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、核因子-κB、WNT等多條信號(hào)通路協(xié)同調(diào)節(jié)HSC的活化，參與肝纖維化的發(fā)病機(jī)制[14]。利用基因敲除模型發(fā)現(xiàn)，Hes1基因的缺失可使肝脂肪變性受到抑制[14]。α-SMA蛋白是HSC活化的標(biāo)志[15]，在肝纖維化及其他器官纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著器官纖維化的加重，α-SMA蛋白表達(dá)增加?？梢奛otch信號(hào)通路參與肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，對(duì)該通路的深入研究，有望為肝纖維化的研究提供新思路，也為臨床治療提供新靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著高脂飼料喂養(yǎng)時(shí)間的推進(jìn)，沙鼠肝組織在脂肪變的基礎(chǔ)上，炎癥和纖維化逐漸加重，同時(shí)組織芯片免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，沙鼠肝組織中代表HSC活化的α-SMA蛋白表達(dá)[15]逐漸增高，Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子Notch3、Hes1也隨纖維化程度的加重而表達(dá)增強(qiáng)，Notch3、Hes1蛋白表達(dá)水平與α-SMA蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯正相關(guān)，提示長(zhǎng)期高脂飲食誘導(dǎo)沙鼠肝組織脂肪變性，在慢性脂肪變的刺激下，Notch信號(hào)通路被激活，肝星狀細(xì)胞活化，轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，分泌α-SMA增加，大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積，打破纖維增生與降解之間的平衡，形成脂肪性肝纖維化。研究表明Notch3/Hes1可能參與高脂誘導(dǎo)的非酒精性肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，抑制其過度表達(dá)可能為非酒精性脂肪性肝纖維化干預(yù)性治療提供新的見解。

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Changes of Notch3/Hes1in Gerbils with the Formation of Nonalcoholic Fatty Liver Fibrosis

CHEN Xi,YAN Maoxiang,CAI Yueqin,et al The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medial University,Hangzhou(310006),China

[Objective]To investigate the dynamic changes of Notch3/Hes1 signaling pathway in Mongolian gerbils with nonalcoholic fatty liver disease and explore their effect in the formation of liver fibrosis.[Methods]Forty-eight male gerbils were randomly divided into normal group and model group in average. Gerbils of the model group were fed with high fat diet while those of the normal group with normal diet.Eight gerbils in each group were killed at the end of 4w,8w and 16w,respectively.The pathological changes of the liver tissue were observed by HE and Masson staining,and the expression of Notch3,Hes1 and α-SMA in liver was detected by tissue microarray immunohistochemistry.[Results]Compared with the normal group,the gerbils fed with high fat diet developed steatosis,inflammation,fibrosis and even cirrhosis gradually.Notch3,Hes1 and α-SMA in normal group only few expressed,while compared with the corresponding period of normal group their expression in model group increased significantly(P＜0.05,P＜0.01).The levels at 8w and 16w were markedly increased compared with those of at 4w（P＜0.05,P＜0.01）.The expression levels of Notch3 and Hes1 were positively correlated with the expression of α-SMA protein(R=0.786 and=0.873,respectively，P＜0.01).[Conclusions]The activity of Notch/Hes signaling pathway enhances in the development of nonalcoholic fatty liver fibrosis in gerbils,suggesting that it may take part in the formation of nonalcoholic fatty liver fibrosis induced by high fat diet.

nonalcoholic fatty liver;hepatic stellate cell;fibrosis;Notch signaling pathway;tissue microarray

R331

A

1005-5509（2017）03-0175-04

10.16466/j.issn1005-5509.2017.03.001

2016-11-11）

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2012C37088）

Fund project:Planed Program of Public Welfare and Technological Application of Zhejiang Province（2012C37088）

陳芝蕓,E-mail:zhiych123@163.com