朱永豹

基因4型戊型肝炎病毒ORF3蛋白氨基酸變異的初步探討

朱永豹

目的 初步探討戊型肝炎病毒（HEV）ORF3蛋白氨基酸變異情況，為其功能研究提供相關(guān)線索。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴增41株基因4型HEV RNA ORF3基因片段，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌JM109篩選陽性克隆測序，然后采用DNAstar軟件將測序結(jié)果翻譯成氨基酸序列，初步探討其變異情況及與基因1型HEV ORF3蛋白差異。結(jié)果 19株HEV RNA ORF3擴增陽性，其長度均為345bp，編碼蛋白含有114個氨基酸，共19個位點突變，突變分布于D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)，D1區(qū)無突變；與基因1型HEV ORF3蛋白比較，基因4型HEV ORF3蛋白的D1區(qū)、D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)均存在一個或多個氨基酸突變，P2區(qū)兩個PXXP基序無突變。結(jié)論 與基因1型HEV ORF3蛋白比較，基因4型HEV ORF3蛋白的D1區(qū)、D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)氨基酸均存在突變，這些變異是否影響我國基因4型HEV ORF3蛋白結(jié)構(gòu)和功能仍需進一步研究；但P2區(qū)兩個PXXP基序高度保守，推測其可能在不同型HEV致病過程中起著重要的作用。

戊型肝炎病毒 ORF3蛋白 氨基酸變異

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）主要流行于衛(wèi)生條件低下的亞非國家，發(fā)達國家也有散發(fā)，嚴重危害人類健康，是一個重要的全球問題，其病原體戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是一種無包膜、單股正鏈RNA病毒，基因組全長約7.2kb，包括三個開放讀碼框（open reading frames，ORFs），其中ORF1蛋白和ORF2蛋白的功能研究比較透徹，而ORF3蛋白功能尚不清楚，近年來研究顯示HEV可能與促進細胞存活、抑制機體免疫反應(yīng)和病毒感染及顆粒裝配、釋放等有關(guān)，這些功能一般是通過ORF3蛋白含有的某些特異氨基酸區(qū)域?qū)崿F(xiàn)的［1-7］，一旦上述區(qū)域的氨基酸發(fā)生突變，ORF3蛋白的結(jié)構(gòu)和功能是否改變不得而知，本研究主要探討基因4型HEV ORF3蛋白氨基酸變異情況，為其功能研究提供一些線索，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集41株基因4型HEV毒株血清標本。

1.2 方法 （1）引物合成：參照文獻［8］報道的引物，上游引物為：5'-CATGGCGATGCCACCATGCGC-3'，下游引物為：5 '- TCAGCGGCGAAGCCCCAGCT-3'，目的片段長度為346 bp，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。（2）病毒RNA提?。喝?00μl血清，采用Trizol試劑（美國GIBCO公司）按其說明書提取血清病毒RNA，最后將RNA溶于20μl DEPC水中。（3）RT-nPCR擴增：20μl逆轉(zhuǎn)錄體系，以oligo（dT）18為逆轉(zhuǎn)錄引物，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（日本TOYOBO公司）42℃逆轉(zhuǎn)錄45min。采用PCR擴增HEV cDNA基因片段，PCR反應(yīng)體系含有逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μl、dNTP各200μmol/L、引物0.6μmol/L、LA Taq酶1.25U和2×GC buffer 12.5μl，總體積為25μl。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，53℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。（4）DNA純化、測序及翻譯：PCR產(chǎn)物DNA片段純化試劑盒純化后，與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌JM109（大連寶生物工程有限公司），藍白篩選陽性克隆，送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序；采用DNAstar軟件將測序結(jié)果翻譯成氨基酸序列。

2 結(jié)果

19株HEV RNA ORF3基因片段擴增陽性，其長度均為345bp，編碼蛋白含有114個氨基酸，共19個位點突變，突變分布于D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)，D1區(qū)無氨基酸突變；與基因1型HEV ORF3蛋白比較，基因4型HEV ORF3蛋白的D1區(qū)、D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)均存在一個或多個氨基酸突變，P2區(qū)兩個PXXP基序無氨基酸突變。見圖1。

圖1 HEV ORF3蛋白氨基酸變異

3 討論

過去一直認為戊型肝炎病毒（HEV）ORF3的基因長度為372bp，編碼123個氨基酸，但后來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ORF3的第三個AUG才是起始密碼子，致使其編碼蛋白縮短，含有112～114個氨基酸［9］。

迄今為止，HEV ORF3蛋白的功能研究主要針對基因1型，研究結(jié)果顯示基因1型HEV ORF3蛋白的N端含有兩個疏水區(qū)（D1區(qū)和D2區(qū)），C端含有兩個多脯氨基酸區(qū)（P1區(qū)和P2區(qū)），其中D1區(qū)富含半胱氨酸，與細胞骨架形成有關(guān)［6］，與Pystl結(jié)合［3］，D2區(qū)與血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合，P1區(qū)存在一個Ser71磷酸化位點［6］，P2區(qū)兩個重疊PXXP基序與許多含有SH3結(jié)構(gòu)域的信號傳導(dǎo)分子結(jié)合［1］，可見ORF3蛋白的功能主要是通過某些特異氨基酸區(qū)域?qū)崿F(xiàn)的，故作者探討基因4型HEV ORF3蛋白氨基酸變異情況及與基因1型HEV ORF3蛋白比較其氨基酸差異，結(jié)果基因4型HEV ORF3蛋白共19個氨基酸位點突變，突變分布于D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)，D1區(qū)無氨基酸突變；與基因1型HEV ORF3蛋白比較，基因4型HEV ORF3蛋白的D1區(qū)、D2區(qū)、P1區(qū)和P2區(qū)均存在一個或多個氨基酸突變，但P2區(qū)兩個PXXP基序無氨基酸突變；其中D1區(qū)相對保守，僅13位點的半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼?，D2區(qū)主要是丙氨酸和纈氨酸的相互替換，P1區(qū)變異較大，變異率高達58.33%，以往熟知的71位點不是絲氨酸，而是替換為苯丙氨酸或酪氨酸，Graff J等曾研究表明ORF3蛋白磷酸化在病毒基因組復(fù)制和感染性病毒顆粒產(chǎn)生過程中并不是必需的［5］，P2區(qū)兩個PXXP基序高度保守，除具有與含有SH3結(jié)構(gòu)域的信號傳導(dǎo)分子結(jié)合的能力外，PSAP基序也與腫瘤易感基因101結(jié)合，從而促進α1微球蛋白的分泌，抑制機體免疫反應(yīng)［4］，完整的PASP基序是病毒顆粒從感染細胞內(nèi)釋放必不可少的［7］，據(jù)此推測PXXP基序在HEV致病過程中可能起著重要的作用，但上述變異是否影響基因4型HEV ORF3蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以致區(qū)別于基因1型HEV ORF3蛋白，仍需進一步研究。

目前關(guān)于基因4型HEV ORF3蛋白的研究較少，而我國臨床上的HE主要由基因4型HEV感染所致，基因1型所致的相對較少，所以更應(yīng)加大基因4型HEV ORF3蛋白的功能研究。

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Objective To preliminarily discuss amino acids mutation in the the ORF3 protein of genotype 4 hepatitis E virus（HEV）ORF3 protein. Methods The ORF3 gene fragment of 41 genotype 4 HEV RNA were amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction（RTPCR）. The PCR products were connected with pMD18-T Vector.After the recombinant plasmids were transformed into E.coli JM109，the positive clones were obtained and sequenced.Then the sequencing results were translated into amino acid with DNAstar software. The amino acid mutations of genotype 4 HEV ORF3 protein were preliminarily discussed. The amino acids differences between genotype 4 and genotype 1 HEV ORF3 protein were also preliminarily discussed. Results The positive ORF3s were amplified in 19 out of 41 genotype 4 HEV. Its length is 345bp，encoding a protein containing 114 amino acids. There were 19 amino acid sites mutation locating in the D2 region，P1 region and P2 region. The D1 region had no amino acids mutation. Compared with that of genotype 1 HEV ORF3 protein，there were one or multiple amino acid mutations in the D1 region，D2 region，P1 region and P2 region of genotype 4 HEV ORF3 protein. The two PXXP motifs of P2 region had no amino acids mutation. Conclusions Compared with that of genotype 1 HEV ORF3 protein，there are some differences in the D1 region，D2 region，P1 region and P2 region of genotype 4 HEV ORF3 protein. Whether these mutations affect the ORF3 protein structure and function of genotype 4 HEV in China needs to be further studied. But the two PXXP motifs of P2 region are highly conserved，suggesting that they may play an important role in the pathogenesis of different genotypes HEV.

hepatitis E virus ORF3 protein Amino acid mutation

236000 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院感染科