陳夏涼 曲凡 金悅?

丹參酮I 對(duì)高雄誘導(dǎo)的PCOS模型大鼠性激素及卵巢功能的影響

陳夏涼 曲凡 金悅?

目的 探討丹參酮I（Tan-I）對(duì)高雄誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征（PCOS）模型大鼠性激素及卵巢功能的影響。方法 通過皮下注射丙酸睪酮建立PCOS大鼠模型。新生雌性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，PCOS+Tan-I高、中、低劑量組和PCOS模型組。結(jié)果 Tan-I顯著降低大鼠血清LH、LH/FSH和FAI的水平，顯著升高大鼠血清FSH的表達(dá)水平，同時(shí)Tan-I顯著升高大鼠卵巢組織中PPARG1水平，降低NCOR1和HDAC3 mRNA的表達(dá)水平。Tan-I對(duì)上述因子的改善作用呈劑量相關(guān)性。結(jié)論 Tan-I通過改善大鼠血清性激素水平以及卵巢功能的表達(dá)水平而達(dá)到治療PCOS的目的。

丹參酮I 高雄 多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡婦女中最常見的婦科內(nèi)分泌疾病。全球范圍內(nèi)5%～10%育齡婦女受此病困擾，該疾病以無排卵性月經(jīng)、不孕、高雄激素血癥和胰島素抵抗為特征［1］。丹參是雙子葉植物唇形科 Labiatae 丹參 Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根，其有效成分有脂溶性和水溶性兩大類。近年來，隨著對(duì)丹參中各類成分研究的不斷深入，其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大并取得了顯著的療效［2-3］。丹參酮I（Tanshinone I，Tan-I）是丹參主要脂溶性成分之一。本文就Tan-I對(duì)高雄誘導(dǎo)的PCOS模型大鼠性激素及卵巢功能的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇新生雌性Sprague-Dawley大鼠15g左右，共50只，由母鼠喂養(yǎng)21d。斷奶后飼養(yǎng)環(huán)境為24h明暗循環(huán)，自由飲食，溫度25℃，濕度55%。隨機(jī)分為正常對(duì)照組，PCOS+Tan-I高、中、低劑量組和PCOS模型組，每組各10只大鼠。PCOS造模大鼠于9日齡時(shí)以0.004ml/g頸部皮下注射溶于橄欖油中的丙酸睪酮（每25mg丙酸睪酮溶于1ml橄欖油中）［4］。正常對(duì)照組大鼠給予相應(yīng)劑量的橄欖油。PCOS+Tan-I高、中、低劑量組是在PCOS造模的基礎(chǔ)上，分別給予不同劑量的Tan-I灌胃處理：200mg/（kg·d）（高劑量組），100mg/（kg·d）（中劑量組），50mg/（kg·d）（低劑量組）。每日陰道涂片觀察動(dòng)情周期。PCOS成模標(biāo)準(zhǔn)：從70日齡起，每日行陰道脫落細(xì)胞涂片后HE染色觀察，持續(xù)10d，若呈現(xiàn)持續(xù)角化上皮，提示排卵障礙；卵巢切片可呈現(xiàn)多囊樣改變；血清中雄激素水平升高。

1.2 方法 10周后，處死大鼠，采集外周血及卵巢組織。大鼠卵巢組織干冰預(yù)冷后-80℃保存。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清中黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、總睪酮（total testosterone，TT）的水平，使用儀器為DPCi2000以及相關(guān)配套試劑。應(yīng)用放射免疫分析法檢測(cè)血清中雌二醇（estradiol，E2）的水平，檢測(cè)使用儀器為上海核所日環(huán)光電儀器有限公司生產(chǎn)的SN-6105，使用試劑為天津九鼎醫(yī)學(xué)生物有限公司出品。采用酶免法（ELISA）檢測(cè)血清中性激素結(jié)合蛋白（sex hormonebinding globulin，SHBG）的水平，使用酶標(biāo)儀型號(hào)為DENLEY DRAGON Wellscan MK，分析軟件為Ascent software for Multiskan。檢測(cè)方法參照說明書進(jìn)行。應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)各組大鼠卵巢組織中關(guān)鍵基因PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA表達(dá)改變，大鼠PPARG1，HDAC3，NCOR1和GAPDH 基因引物由上海生工公司提供。Tan-I購于西安鴻生生物技術(shù)有限公司。丙酸睪酮購于美國(guó)SIGMA公司。游離雄激素指數(shù)（FAI）FAI=TT（nmol/L）/SHBG（nmol/L）×100。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tan-I 對(duì)各組大鼠血清性激素水平的影響 除各組大鼠血清E2水平和PCOS+Tan-I高劑量組大鼠血清FSH水平外，其余各組大鼠血清LH，LH/FSH和FAI水平均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；FSH水平均顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。除各組大鼠血清E2水平和PCOS+Tan-I低劑量組大鼠血清LH水平外，其余各組大鼠血清LH，LH/FSH和FAI水平均顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.05）；FSH水平均顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。除血清E2水平外，Tan-I對(duì)PCOS模型大鼠血清LH，F(xiàn)SH，LH/FSH和FAI的改善作用呈劑量相關(guān)性。見表1。

表1 各組大鼠血清性激素水平（x±s）

2.2 Tan-I對(duì)各組大鼠卵巢組織中PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA表達(dá)的影響 正常對(duì)照組大鼠卵巢組織中PPARG1mRNA表達(dá)水平顯著高于其余各組（P＜0.05）。模型對(duì)照組大鼠卵巢組織中PPARG1mRNA表達(dá)水平顯著低于其余各組（P＜0.05）。正常對(duì)照組大鼠卵巢組織 中NCOR1和HDAC3 mRNA表達(dá)水平顯著低于其余各組（P＜0.05）。模型對(duì)照組大鼠卵巢組織 中NCOR1和 HDAC3 mRNA表達(dá)水平顯著高于其余各 組（P＜0.05）。Tan-I對(duì) PCOS模型大鼠卵巢組織 中PPARG1、NCOR1和 HDAC3 mRNA表達(dá)水平的改善作用呈劑量相關(guān)性。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織中PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA表達(dá)水平

3 討論

丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在歷代本草中均有收載，被列為上品。古代常用于治療月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕積聚、肝脾腫大、心絞痛等病癥［2-3］。丹參來源充足，價(jià)格低廉，使用方便，臨床進(jìn)一步深入研究并推廣應(yīng)用。

PPARG 是核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族的一員，其參與了體內(nèi)糖脂代謝、細(xì)胞增殖凋亡等過程，影響PCOS、肥胖等代謝性疾病的發(fā)生。PPARG的不同亞型在生殖和代謝系統(tǒng)中分別發(fā)揮著舉足輕重的作用。其中，PPARG1是在卵巢中占主導(dǎo)地位的一個(gè)亞型，在卵巢正常功能的維持上起著多方面的關(guān)鍵作用，具體涉及了顆粒細(xì)胞的增殖與分化，糖-胰島素穩(wěn)態(tài)的維持，甾體激素的生成，卵巢的組織重塑等［5］。Pioglitazone和rosiglitazone 等PPARG的激動(dòng)劑能夠緩解臨床PCOS患者的高雄癥和排卵障礙［6］，提示PPARG在卵巢卵泡發(fā)育中的重要作用，而PCOS 患者存在PPARG 的功能受損。作為核轉(zhuǎn)錄因子，PPARG 的轉(zhuǎn)錄活性需要多種共調(diào)節(jié)子的共同參與協(xié)同完成，NCOR1 和HDAC3是其中兩個(gè)最重要的共抑制子［7］。NCOR1 是一個(gè)具有復(fù)雜功能域的大蛋白，其接受核受體的招募而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制路通，可與HDAC3穩(wěn)定結(jié)合后成為HDAC3 的激活亞單位，其對(duì)個(gè)體的生殖發(fā)育過程至關(guān)重要［8］。本研究選擇TT、SHBG、FAI、LH和FSH 反映Tan-I對(duì)高雄誘導(dǎo)的PCOS模型大鼠的影響。LH、FSH反映PCOS具有較高的臨床實(shí)用價(jià)值［9］。SHBG 和FAI是反映PCOS患者高雄狀態(tài)的最佳指標(biāo)，SHBG是調(diào)節(jié)體內(nèi)雄激素水平、活性和雌雄激素比例的重要蛋白，其是重要的信號(hào)分子，在卵泡等生殖細(xì)胞發(fā)育成熟中起重要作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)Tan-I顯著降低大鼠血清LH、LH/FSH和FAI的水平，顯著升高大鼠血清FSH的表達(dá)水平，同時(shí)Tan-I顯著升高大鼠卵巢組織中PPARG1水平，降低NCOR1和HDAC3 mRNA的表達(dá)水平。Tan-I對(duì)上述因子的改善作用呈劑量相關(guān)性。Tan-I通過改善大鼠血清LH、FSH、LH/FSH和FAI水平以及卵巢組織中PPARG1、NCOR1和HDAC3 mRNA的表達(dá)水平而達(dá)到治療PCOS的目的。

［1］ Knochenhauer ES,Key TJ,Kahsar-Miller M,et al.Prevalence of the polycystic ovary syndrome in unselected black and white women of the southeastern United States: a prospective study.J Clin Endocrinol Metab,1998,83(9):3078-3082.

［2］ 朱瑄.丹參的實(shí)驗(yàn)藥理研究進(jìn)展.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010,4(15):230-231.

［3］ 鄧惠英.丹參及其有效成分的藥理研究概況.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2007,23(12):1812-1813.

［4］ Tamura N,Kurabayashi T,Nagata H, et al.Effects of testosterone on cancellous bone,marrow adipocytes,and ovarian phenotype in a young female rat model of polycystic ovary syndrome.Fertil Steril,2005,84 (Suppl 2):1277-1284.

［5］ Froment P,Gizard F,Staels B,et al.A role of PPARgamma in reproduction?Med Sci,2005,21(5):507-511.

［6］ Sepilian V,Nagamani M.Effects of rosiglitazone in obese women with polycystic ovary syndrome and severe insulin resistance.J Clin Endocrinol Metab,2005,90(1):60-65.

［7］ Alenghat T, Meyers K, Mullican SE, et al. Nuclear receptor corepressor and histone deacetylase 3 govern circadian metabolic physiology. Nature, 2008, 456(7224):997-1000.

［8］ Guenther MG,Barak O,Lazar MA.The SMRT and N-CoR corepressors are activating cofactors for histone deacetylase 3.Mol Cell Bio,2001,21(18):6091-6101.

［9］ Koskinen P,Penttila TA,Anttila L,et al.Optimal use of hormone determinations in the biochemical diagnosis of the polycystic ovary syndrome.Fertil Steril,1996,65(3):517-522.

［10］ Forges T,Gerard A,Hess K, et al.Expression of sex hormonebinding globulin（SHBG) in human granulosa-lutein cells.Mol Cell Endocrinol,2004,219(1-2):61-68.

Objective To explore the effects of Tanshinone I on the expression of sex hormones and ovarian functions in the model rat with PCOS induced by hyperandrogenism. Methods The PCOS model rats were established by injecting subcutaneously with testosterone propionate. The SD rats were randomly divided into normal group，PCOS+ high，medium，low dose of Tan-I and PCOS model group. Results Tan-I significantly decreased the serum levels of LH，LH/FSH，F(xiàn)AI，NCOR1mRNA as well as HDAC3mRNA and increased the serum levels of FSH，PPARG1mRNA expression，which were dose-dependent. Conclusions Tanshinone I can function well in curing PCOS through regulating the expression of sex hormones and ovarian functions in the model rat with PCOS induced by hyperandrogenism.

Tanshinone I Hyperandrogenism Polycystic ovary syndrome

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015ZB024）

310003 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院（陳夏涼 金悅）310006 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院（曲凡）*通信作者