楊積鵬，朱艷，曹春梅，李寶軍，孫振紅，趙新民,李生娥，葛向珍

甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070

1 前沿

硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum)是引起馬鈴薯干腐病的重要病原物，可通過塊莖表皮的傷口、種薯帶菌或土壤傳播的方式侵入塊莖，導致貯藏期塊莖發(fā)病腐爛，整個塊莖僵縮或干腐 [1]。據(jù)統(tǒng)計，馬鈴薯貯藏病害平均病薯率約30%，其中由鐮刀菌引起的干腐型病薯約占90%，該菌還具有較強的分泌真菌毒素的能力，主要包括單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、串珠鐮刀菌素等，具有潛在的致癌性，容易引發(fā)食品安全隱患問題[2]。因此，F(xiàn). sulphureum引起的干腐病是限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要采后病害之一[1]。

雖然化學殺菌劑處理能有效地控制馬鈴薯干腐病，但是，化學藥物的使用存在環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、病原物易于產(chǎn)生抗藥性等危害[3]，因此，尋找新的有效控制F. sulphureum的方法尤為重要。綠原酸是果實是植物代謝中的重要次生代謝產(chǎn)物，具有清除自由基、抗氧化等作用[4]，對絲狀真菌也有一定的抑制作用，是安全無污染的植物源抗菌物質[5]。但是有關綠原酸處理對F. sulphureum的抑制及對干腐病的控制研究還較少。

本試驗以菌絲生長和孢子的萌發(fā)為指標，研究了不同濃度綠原酸處理對F. sulphureum的抑制影響和對馬鈴薯干腐病的控制作用，以期為綠原酸在控制F. sulphureum引起的馬鈴薯貯藏病害提供部分理論依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 材料與試劑

試供菌株F. sulphureum，為本實驗室保存。綠原酸為分析純，購自Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司。馬鈴薯為隴薯3號（Solanum tuberosum Longshu No.3），購于甘肅省農(nóng)科院馬鈴薯研究所。

2.2 方法

2.2.1 病原菌的分離、純化和培養(yǎng)

參照方中達方法[6]，將菌株在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)7d后用打孔器打直徑為0.5cm的小菌餅，于新鮮的PDA平板中28℃恒溫培養(yǎng)7d待用。2.2.2孢子懸浮液的配制

參照Bi等[7]方法。取培養(yǎng)好的菌體，加含0.05%Tween80的無菌水約10mL，用玻璃棒刮下平板上的孢子轉入三角瓶中，充分振蕩后，用雙層紗布過濾，濾液用血球計數(shù)板計數(shù)，并稀釋至1×106個/mL。

2.2.3 MTT比色法確定綠原酸的抑菌濃度

采用Eloff等人的方法[8]并略做修改，96孔培養(yǎng)板在紫外線下照射10min后每孔加入無菌的PDB培養(yǎng)基、綠原酸的溶液、菌懸液及噻唑藍(MTT)指示劑，使指示劑的終濃度為0.5mg/mL，綠原酸的終濃度梯度依次為0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10 mM，各濃度設3個平行。培養(yǎng)物在無菌條件下28℃保溫24h后，用全波長酶標儀（Multiskan TM GO）在490nm波長處測定光吸收值，確定綠原酸的抑菌濃度，試驗重復3次 。

2.2.4 綠原酸對F. sulphureum生長的影響

參照葛永紅方法[9]并改進。將培養(yǎng)7d的F. sulphureum打成5mm的菌餅接種到添加濃度分別為2.5、5、10mM綠原酸的PDA上，以不添加綠原酸的PDA為對照，分別在3d、5d、7d后測量菌落直徑(十字交叉法)確定綠原酸對F. sulphureum 對菌落生長速度的影響。5mm的菌餅接種在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d后過濾烘干菌絲，以菌絲干重測定綠原酸對菌絲生物量的影響。每個處理重復3次。

2.2.5 綠原酸對F. sulphureum孢子萌發(fā)的影響

參照葛永紅方法[9]并修改，將綠原酸分別加入含5mLPDB培養(yǎng)基的試管中，使其終濃度分別為0、2.5、5、10 mM，同時接種100μL的孢子懸浮液，28℃搖床（200 r/min）培養(yǎng)24h后，用載玻片在光學顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，每個處理計數(shù)100個孢子，重復3次。

2.2.6 綠原酸處理后對F. sulphureum接種馬鈴薯切片病斑的抑制

參照Ray和Hammerschmidt的方法[10] ，選擇外觀整齊、無損傷的隴薯3號塊莖，經(jīng)次氯酸鈉擦洗后將塊莖切成一定厚度的切片，用打孔器打成切片，再經(jīng)酒精消毒后，置于已滅菌的濕濾紙上，在黑暗的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中25℃放置4h后，分別取500μL濃度為2.5、5、10 mM 的綠原酸溶液，用滅菌接種環(huán)均勻涂布后在25 ± 2℃的溫度下孵育24h后，接種7d菌齡直徑為4mm的F. sulphureum菌餅，每個處理共10個切片，以無菌水處理為對照。切片于黑暗的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中25℃放置3d，用十字交叉法測量病斑直徑，試驗重復3次。

2.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

全部試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007計標準誤差并作圖，SPSS19.0進行差異顯著性分析。圖中豎線表示標準偏差（±SE），字母表示在P<0.05水平下具有統(tǒng)計學水平上的顯著差異性。

3 結果與分析

3.1 MTT比色法分析綠原酸對F. sulphureum的抑菌濃度

MTT比色法測定最小抑菌濃度的原理是基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍紫色結晶甲臢（Formazan）并沉積在細胞中，使活細胞呈現(xiàn)藍色，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臢，在490nm波長有特定的光吸收值，在一定細胞數(shù)量范圍內，MTT結晶形成的甲臢與活細胞數(shù)成正比，因此，酶標儀測得的吸光度值（OD490）可以判斷活細胞數(shù)量，OD值越大，細胞活性越強，藥物的抑制作用越小。由圖1可知，在490nm波長處，不加綠原酸的對照處理吸光值約為0.278±0.01。隨著綠原酸濃度的增大，吸光值逐漸降低，說明死細胞數(shù)逐漸增高。與對照相比，2.5 mM綠原酸處理后，死亡的細胞數(shù)表現(xiàn)出統(tǒng)計學意義上的顯著差異，5 mM綠原酸可極顯著抑制F. sulphureum，使其死亡。

圖1：不同濃度綠原酸處理對F. sulphureum吸光值的影響

3.2 綠原酸處理對F. sulphureum菌絲生長的影響

菌落直徑代表了一定時間F. sulphureum在PDA培養(yǎng)基上的徑向生長速度。如圖2A所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，F(xiàn). sulphureum在PDA培養(yǎng)基上的菌落逐漸增大，但綠原酸均可抑制F. sulphureum的徑向擴展速度，并呈現(xiàn)濃度效應。F. sulphureum的菌絲生物量也能夠被檸檬酸有效抑制(圖2B)。與對照相比，2.5 mM的綠原酸處理菌絲干重減少了24.1%，10mM和15mM處理組中，菌絲生物量分別比對照組降低了55.6%和60.2%，在p<0.05的水平下均表現(xiàn)出統(tǒng)計學水平的差異性。

圖2：不同濃度綠原酸處理對F. sulphureum菌絲生長的影響。A為菌落直徑，B為菌絲生長量

3.3 綠原酸處理對F. sulphureum孢子萌發(fā)的影響

不同濃度的綠原酸孵育培養(yǎng)24 h后，F(xiàn). sulphureum的孢子萌發(fā)率表現(xiàn)不同。對照組、2.5mM 、5mM和10mM處理組孢子萌發(fā)率分別為39.72%、22.79%、12%和10.05%。與對照相比，2.5mM綠原酸使孢子的萌發(fā)率降低了42.62%，5mM綠原酸處理后，孢子萌發(fā)被顯著抑制，降低了69.79%（圖3）。這些結果說明不同濃度的綠原酸在孢子啟動萌發(fā)過程中，具有一定的調節(jié)作用，抑制了孢子的萌發(fā)，且隨著濃度的增高，這種抑制作用越明顯。

圖3：不同濃度綠原酸處理對F. sulphureum孢子萌發(fā)的影響

3.4 綠原酸處理對接種馬鈴薯切片病斑直徑的影響

隴薯3號馬鈴薯是甘肅省主栽的重要高淀粉品種，但存在易感病不耐貯藏的特點，因此，試驗選擇隴薯3號研究綠原酸處理對干腐病發(fā)生的影響。由圖4可知，綠原酸孵育后接種F. sulphureum菌餅，3d后切片均發(fā)病。對照組、2.5mM 、5mM和10mM處理組病斑直徑（未去除菌餅的直徑）分別為18mm、10mm、7mm和6.8mm。與對照相比，2.5mM綠原酸使隴薯3號馬鈴薯干腐病病斑直徑的擴展降低了44.44%，在P<0.05水平上具有顯著差異。

圖4：不同濃度綠原酸處理對F. sulphureum馬鈴薯切片在不同培養(yǎng)時間下的病斑直徑

4 結論

綠原酸能有效抑制F. sulphureum孢子萌發(fā)、菌落直徑和菌絲生物量，同時可顯著抑制感病馬鈴薯隴薯3號的干腐病的發(fā)生，抑制效果與濃度呈正相關。

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