孫慶惠， 楊白雪， 巴兆粉， 吳國營， 楊洪江

·論著·

銅綠假單胞菌亞胺培南中介菌株oprD基因分析

孫慶惠， 楊白雪， 巴兆粉， 吳國營， 楊洪江

目的分析銅綠假單胞菌臨床分離株對亞胺培南耐藥機制。方法采用VITEK32系統(tǒng)分析臨床菌株耐藥性；紙片協(xié)同法和紙片擴散法分析金屬β內(nèi)酰胺酶和AmpC β內(nèi)酰胺酶活性；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）方法分析臨床菌株的外膜蛋白OprD的表達；PCR法擴增基因oprD并測序分析；隨機擴增多態(tài)性DNA標記方法對臨床菌株進行分型。結(jié)果7株菌確認為亞胺培南中介株，其中2株菌外膜通道蛋白OprD可能存在缺失，進一步分析發(fā)現(xiàn)其編碼基因被插入序列ISRP10阻斷。其余5株菌OprD蛋白大小存在差異，相應編碼區(qū)大小為427～443個氨基酸，OprD蛋白二級結(jié)構轉(zhuǎn)角區(qū)域L1-L8處均存在多種氨基酸替代或缺失。結(jié)論銅綠假單胞菌被插入序列ISRP10阻斷失能，或其外膜蛋白基因oprD及OprD蛋白二級結(jié)構轉(zhuǎn)角區(qū)域的氨基酸突變，導致臨床分離株對亞胺培南呈中介。

銅綠假單胞菌； 亞胺培南中介； ISRP10； oprD基因

銅綠假單胞菌是常見的條件致病菌，可引起燒傷或免疫力低下患者感染，導致血流感染和泌尿系感染等疾病，在囊性纖維化肺炎（cystic fbrosis）患者中，銅綠假單胞菌感染能造成嚴重傷害甚至死亡[1]。

亞胺培南為碳青霉烯類抗生素，抗菌譜廣、抗菌活性強，成為臨床上治療銅綠假單胞菌感染的常用抗菌藥物[2]。然而，隨著碳青霉烯類的廣泛應用甚至不合理使用，導致臨床分離菌株對亞胺培南的耐藥率逐年增加[3-4]。

針對臨床分離的9株銅綠假單胞菌，本研究對其進行了藥敏分析，發(fā)現(xiàn)其中2株為亞胺培南敏感菌株，7株為亞胺培南中介菌株。進一步分析了銅綠假單胞菌外膜通道蛋白OprD的表達水平以及基因oprD的序列，確定臨床分離菌株亞胺培南的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 材料

9株臨床銅綠假單胞菌分離于2009年9月－2010年10月天津市兒童醫(yī)院住院患兒痰液標本，質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853（來自天津市兒童醫(yī)院）和實驗室菌株PAK[5]用于實驗對照。

1.2 方法

1.2.1 藥敏方法 采用法國 Bio-Mérieux公司的VITEK32系統(tǒng)檢測臨床分離銅綠假單胞菌對哌拉西林-他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢曲松、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星共10種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果判定采用2015年CLSI頒布標準。 采用紙片協(xié)同法和紙片擴散法檢測金屬β內(nèi)酰胺酶和AmpC β內(nèi)酰胺酶的活性[6-7]。

1.2.2 外膜蛋白OprD分析 OprD外膜蛋白的制備依據(jù)參考文獻[8]。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法分析外膜蛋白，分離膠濃度為12 %，濃縮膠濃度為5 %。取外膜蛋白樣品20 μL加入等體積2×上樣緩沖液，100?℃加熱15 min使蛋白變性。經(jīng)過上樣、電泳、染色、脫色等步驟，在凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 PCR擴增 oprD基因及序列分析使用primer primer 5軟件設計擴增基因oprD引物，目的產(chǎn)物大小為1 412 bp（編碼區(qū)為1 332 bp），上游引物oprD-F（5’ -CGCCGACAAGAAGAACTAGC-3’），下游引物oprD-R（5’-GTCGATTACAGGATCGACAG-3’）。PCR反應總體積為25 μL，擴增條件為95?℃預變性10 min，95?℃變性5 s、63.8?℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，共進行35個循環(huán)，72?℃延伸10 min。在0.8 %瓊脂糖凝膠上進行電泳，分析PCR產(chǎn)物。

對PCR產(chǎn)物進行測序，分別在假單胞菌基因組網(wǎng)站（www.pseudomonas.com）和NCBI網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對分析獲得的序列。

1.2.4 隨機擴增多態(tài)性DNA標記（randomly amplifed polymorphic DNA，RAPD）分型 按參考文獻[9]提供的方法，進行RAPD分型。引物采 用OPB-07（5’ -GGTGACGCAG-3’） 和272（5’ -AGCGGGCCAA-3’）。擴增采用兩步PCR方法，第1階段包括94?℃變性5 min、36?℃退火5 min和72?℃延伸5 min，進行4個循環(huán)；第2階段包括94?℃預變性1 min、94?℃變性1 min、36?℃退火1 min和72?℃延伸2 min，進行35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.2 %的瓊脂糖凝膠上進行電泳。采用軟件GelQuest（http：//sequentix.de/gelquest/index.php）進行分析電泳結(jié)果，確定菌株之間的同源關系。

2 結(jié)果

2.1 細菌耐藥性監(jiān)測

9株銅綠假單胞菌的藥敏試驗結(jié)果見表1，其中2株對亞胺培南敏感，7株為中介菌株。檢測9株臨床菌株的金屬β內(nèi)酰胺酶和AmpC β內(nèi)酰胺酶活性，均為陰性。

2.2 SDS-PAGE分析外膜通道蛋白OprD的表達

提取銅綠假單胞菌菌株的外膜蛋白，進行SDS-PAGE分析，外膜通道蛋白OprD相對分子質(zhì)量大約為45 500[10]。根據(jù)蛋白質(zhì)電泳中OprD蛋白的可能位置，初步將11株銅綠假單胞菌分為3個組。組I包括菌株PAK和ATCC27853，OprD蛋白大小一致；組Ⅱ包括亞胺培南敏感菌株TJ91和TJ169，其OprD蛋白大小與對照菌株相似；組Ⅲ為亞胺培南中介菌株，其中菌株TJ40和TJ180的OprD蛋白條帶可能缺失，其余菌株的可能OprD蛋白，其條帶大小存在差異（圖1）。

2.3 PCR法分析oprD基因

為進一步確認SDS-PAGE的分析結(jié)果，擴增臨床菌株的基因oprD，發(fā)現(xiàn)OprD蛋白缺失的菌株TJ40和TJ180的oprD基因大小為2.5 kb，比正常oprD基因多出1.1 kb，推測該基因可能存在插入突變；其余5株中介菌株的基因oprD擴增大小為1.4 kb左右，編碼的蛋白質(zhì)大小為427～443個氨基酸（圖2）。

2.4 oprD基因的插入序列分析

將PCR產(chǎn)物測序，通過比對分析大小為2.5 kb的oprD基因序列，發(fā)現(xiàn)菌株TJ40和TJ180的oprD基因編碼區(qū)均存在一個插入片段，大小均為1 116 bp，插入位點都位于503～504 bp。該插入序列與固氮斯假單胞菌（Pseudomonas stutzeri A1501） （GenBank Accession CP000304）基因組中的重復序列ISRP10的相似度為99 %。

表1 9株銅綠假單胞菌的藥敏試驗Table 1 Antibiotic susceptibility analysis of clinical strains of Pseudomonas aeruginosa

圖1 SDS-PAGE分析臨床菌株外膜蛋白Figure 1 Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis showing outer membrane protein （OMP）profles of clinical strains of Pseudomonas aeruginosa

圖2 PCR擴增臨床菌株oprD基因Figure 2 PCR amplifcation of oprD gene from clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa

插入序列ISRP10的G+C含量為60.22 %，末端存在27 bp反向重復序列（IRs），該末端不是非常完美的反向重復，在反向重復序列中存在5個堿基不完全匹配。通過網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html）進行分析，發(fā)現(xiàn)ISRP10存在1個342個氨基酸的讀碼框（ORF），編碼假定轉(zhuǎn)座酶（圖3）。

2.5 正常大小oprD基因的序列分析

分別擴增菌株TJ84、TJ111、TJ141、TJ162和TJ176的oprD基因，測序后與PAO1的OprD蛋白氨基酸序列進行比對（圖4）。菌株TJ84的oprD基因編碼441 aa，在轉(zhuǎn)角區(qū)域18個位置發(fā)生氨基酸替代或缺失，包括L1（S57E和S59R）、L4（E230K）、L5（ A267S）、L6（R310G）、L7（V360L，M373V，S374D，D375S， N376S，N377S，V378S，G379Y，Y380-，K381-，N382A，Y383G，G384L）。

菌株TJ111的oprD基因編碼438 aa，在轉(zhuǎn)角區(qū)域9個位置發(fā)生氨基酸替代，包括L2（T103S和K115T）、L3（F170L、E185Q、P186G、V189T）、L6（R310E）和L8（G425A，E431D）。

菌株TJ141的oprD基因編碼427 aa，在轉(zhuǎn)角區(qū)域21個位置發(fā)生氨基酸替代或缺失，包括L1（S57E和 S59R）、L4（E230K）、L5（N262T和 A267S）、L6（R310G）、L7（V360L，M373V，S374D，D375S，N376-，N377S，V378S，G379Y，Y380-，K381-，N382A，Y383G，G384L）和L8（N432-，N433-）。

圖3 插入序列ISRP10 插入臨床菌株的oprD基因（PAO1為參比菌株）Figure 3 Schematic representation of the oprD gene of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates， which is disrupted by ISRP10 compared to reference strain PAO1

圖 4 OprD蛋白氨基酸序列多重比對分析Figure 4 Multiple amino acid alignment （UPGMA） of OprD

菌株TJ162的oprD基因編碼443 aa，在轉(zhuǎn)角區(qū)域5個位置發(fā)生氨基酸替代，包括L3（F170L、E185Q、P186G、V189T）和L4（E230K）。

菌株TJ176的oprD基因編碼441 aa，在轉(zhuǎn)角區(qū)域23個位置發(fā)生氨基酸替代或缺失，包括L1（N52D，S57E和S59R）、L3（F170L、E185Q、P186G、V189T）、L4（E230K）、L5（ A267S）、L6（R310G）、L7（V360L，M373V，S374D，D375S， N376S，N377S，V378S，G379Y，Y380-，K381-，N382A，Y383G，G384L）。

2.6 RAPD分析

采用RAPD方法，對11株銅綠假單胞菌的分析結(jié)果如圖5所示。采用隨機引物OPB-07進行擴增分析，所有菌株的OprD可分為3個簇，進一步分為7個亞簇（圖5A）；采用隨機引物272進行擴增分析，可分為7個簇或亞簇（圖5B）。結(jié)果顯示，兩條引物將11株銅綠假單胞菌分成不同的集合，它們的來源不是同一菌株，具有較顯著的遺傳多樣性。

3 討論

A， Profile generated by primer OPB-07； B， Profile generated by primer 272.圖5 銅綠假單胞菌的RAPD分型Figure 5 Random amplifed polymorphic DNA （RAPD）analysis of the clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa

銅綠假單胞菌外膜蛋白OprD有多種突變方式，但關于大片段插入失活突變的報道不多。Wang等[11]曾發(fā)現(xiàn)4株菌由于大片段插入失活突變。2株菌的插入序列相同都為ISPa1328；另2株菌的插入序列分別為ISPre-like和 IS5，且這3種插入序列都屬于IS5家族。Guzvinec等[12]曾報道，oprD基因翻譯起始密碼69 bp處插入ISRP10，導致該菌株對亞胺培南耐藥。

本研究中，2株菌株是由于插入序列ISRP10而引起對亞胺培南中介。RP10首次于固氮斯假單胞菌中發(fā)現(xiàn)，在該基因組中重復3次[13]，且該序列與假單胞菌屬 ZM2菌株中的插入序列 ISPsp7同源性為98 %，該插入序列屬于IS30家族[14]。

OprD蛋白在細胞膜表面由16條肽鏈組成跨膜集束結(jié)構，膜外形成8個較長的環(huán)狀結(jié)構，周質(zhì)空間形成8個較短轉(zhuǎn)角區(qū)域[15]。外膜蛋白OprD轉(zhuǎn)角區(qū)域L1和L6與亞胺培南和OprD孔道打開無關，轉(zhuǎn)角區(qū)域L2和L3與亞胺培南的結(jié)合相關，轉(zhuǎn)角區(qū)域L4與孔蛋白的合成相關，轉(zhuǎn)角區(qū)域L5、L7和L8收縮可使OprD通道打開，并且可防止非特異性的抗生素進入菌體[16-17]。

本研究中，菌株TJ111在外膜蛋白OprD轉(zhuǎn)角區(qū)域發(fā)生的氨基酸替換，與Gutiérrez 等[17]的報道相同。菌株TJ111、TJ162和TJ176在轉(zhuǎn)角區(qū)域L3發(fā)生的氨基酸替換，分別與顏英俊等[18]和Wang等[11]所報道的突變相同。因此，菌株TJ111、TJ162和TJ176可能由于OprD蛋白轉(zhuǎn)角區(qū)域L2和L3發(fā)生的氨基酸替換或缺失，使外膜蛋白OprD的構象發(fā)生改變，從而導致對亞胺培南中介。菌株TJ84和TJ141在轉(zhuǎn)角區(qū)域L4存在相同的氨基酸替換，同樣可能導致OprD蛋白空間構象發(fā)生改變，從而引起菌株對亞胺培南中介。

有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白OprD的轉(zhuǎn)角區(qū)域L7中的12 個氨基酸殘基 350- MSDNNVGYKNYG-361 被10個氨基酸殘基350-VDSSSSYAGL-359取代，使其對美羅培南耐藥，而對亞胺培南敏感[19]。本研究中，亞胺培南中介菌株中的3株，OprD在轉(zhuǎn)角區(qū)域L7發(fā)生了突變，即373-MSDNNVGKNYG-384被373-VDSSSSY--AGI-384或373-VDS-SSY--AGI-384所取代。該突變是否會影響蛋白OprD的空間構象和功能，從而導致亞胺培南不能有效進入胞內(nèi)，需要進一步確認。

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Analysis of oprD gene in imipenem-intermediate clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa

SUN Qinghui, YANG Baixue, BA Zhaofen, WU Guoying, YANG Hongjiang. （Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China）

ObjectiveTo analyze the mechanism of imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates.MethodsAntibiotic resistance was analyzed using VITEK32 system. Metallo β-lactamase activity was determined by doubledisc synergy test. Amp C β-lactamase activity was determined by Kirby-Bauer disc method. OprD protein was analyzed by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis. PCR was performed to amplify gene oprD. The amplified products were subject to sequencing analysis. The phylogenetic relationship was determined using random amplifed polymorphic DNA (RAPD) method.ResultsMembrane protein OprD was analyzed in 7 clinical isolates of imipenem-intermediate P. aeruginosa. Two strains were devoid of OprD proteins and the corresponding oprD genes were found disrupted by the insertion element ISRP10 in the coding regions. Five strains had OprD proteins with different sizes. Sequence analysis showed that the peptides ranged from 427 to 443 amino acids. Multiple amino acid substitutions and / or deletions were found within the Loop 1 through Loop 8 of the OprD secondary structures.ConclusionsISRP10 inactivation and amino acid substitutions in oprD gene confer imipenem resistance in the clinical isolates of P. aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa; imipenem intermediate; ISRP10; oprD gene

R378.991

A

1009-7708 （ 2017 ） 02-0177-05

10.16718/j.1009-7708.2017.02.011

2016-05-22

2016-07-29

國家自然科學基金（31370205，30970114）。

天津科技大學生物工程學院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457。

孫慶惠（1990－），女，碩士研究生，主要從事微生物與生化藥學。

楊洪江， E-mail：hongjiangyang@tust.edu.cn。