郭 燕， 吳 湜， 傅祝英杰， 楊 洋， 胡付品， 朱德妹

·論著·

血液和無菌體液分離金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的敏感性及毒力基因檢測

郭 燕， 吳 湜， 傅祝英杰， 楊 洋， 胡付品， 朱德妹

目的了解1999－2014年復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院血液和腦脊液等無菌體液中分離的金黃色葡萄球菌（金葡菌）對臨床常用抗菌藥物的敏感性及其毒力基因檢測。方法采用瓊脂稀釋法測定萬古霉素等抗菌藥物對臨床分離金葡菌的最低抑菌濃度（MIC）；采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測MRSA的耐藥基因mecA、mecC及其毒力基因PVL和sasX。結(jié)果258株金葡菌中MRSA菌株占54.3 %（140 / 258），MSSA占45.7 %（118 / 258），血液、腦脊液和胸腹水等無菌體液中MRSA的檢出率由1999－2002年的71.9 %逐年下降至2011－2014年的43.7 %。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：MRSA對多數(shù)受試抗菌藥物的耐藥率均高于MSSA。MSSA對受試抗菌藥仍然十分敏感，細(xì)菌耐藥率除青霉素外，均≤11 %。β內(nèi)酰胺類（除青霉素外）對MSSA的MIC90值均≤1 mg / L。未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺耐藥株。90株臨床分離的MRSA mecA基因陽性檢出率為100 %，未檢測到mecC基因； sasX基因的陽性檢出率為46.7 %，未檢測到PVL基因。sasX陽性的MRSA和sasX陰性的MRSA菌株對β內(nèi)酰胺類抗生素、磷霉素和左氧氟沙星均高度耐藥，但sasX陽性MRSA菌株對阿米卡星和甲氧芐啶-磺胺甲 唑的耐藥率均高于sasX陰性的MRSA菌株。結(jié)論MRSA對臨床多數(shù)抗菌藥物耐藥，為臨床合理應(yīng)用抗菌藥物，應(yīng)重視和加強(qiáng)對金葡菌中MRSA的監(jiān)測。

金黃色葡萄球菌； 無菌體液； 抗菌藥物敏感性

金黃色葡萄球菌（金葡菌）能產(chǎn)生多種毒素、酶和抗原蛋白，具有較強(qiáng)的致病力[1]，是引起感染性疾病的重要病原菌之一。其中甲氧西林耐藥金葡菌（MRSA）對所有的β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，并對大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等大多耐藥[1]。甲氧西林耐藥是由mecA基因介導(dǎo)的，此基因編碼青霉素結(jié)合蛋白（PBP）2a。凡在金葡菌中檢測到mecA基因或者其編碼的PBP2a即為MRSA菌株[2]。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道苯唑西林耐藥、mecA基因陰性的MRSA中檢測到mecC基因，為介導(dǎo)甲氧西林耐藥的另外一種機(jī)制[3]。2012年Li等[4]發(fā)現(xiàn)在金葡菌中存在一種細(xì)胞壁錨定蛋白受控于sasX（Staphylococcus aureus surface protein X）編碼基因。此sasX基因主要存在于醫(yī)院環(huán)境內(nèi)致病性金葡菌中。為了解復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院臨床分離的金葡菌對多種抗菌藥物的敏感性和金葡菌相關(guān)的毒力基因，我們收集了本院1999－2014年分離培養(yǎng)的258株金葡菌，采用瓊脂稀釋法進(jìn)行抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）的測定，同時(shí)采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法對金葡菌攜帶的相關(guān)耐藥基因等進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

1.1.1.1 臨床菌株 收集1999－2014年本院臨床分離的258株金葡菌（剔除同一患者相同部位重復(fù)菌株）進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。受試金葡菌主要分離自血液（77.1 %）、腦脊液（7.8 %）、胸腹水（7.4 %）等無菌體液標(biāo)本。

1.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 金葡菌ATCC 29213為本院抗生素研究所菌種庫保存菌株。

1.1.2 抗菌藥物 包括萬古霉素、替考拉寧、去甲萬古霉素、青霉素、苯唑西林、氨芐西林、舒巴坦、頭孢唑林、阿米卡星、慶大霉素、利福平、左氧氟沙星、磺胺甲唑、甲氧芐啶、磷霉素等標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院技術(shù)服務(wù)部，利奈唑胺為英國Sequoia Research Products公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 哥倫比亞血平皿和藥敏試驗(yàn)用Mueller-Hinton瓊脂均為英國OXOID公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；PCR試劑為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.4 PCR引物 根據(jù)相應(yīng)文獻(xiàn)合成PCR引物，見表1[5-8]。

1.2 方法

1.2.1 抗菌藥物MIC測定 按2012年CLSI M07-A9[9]推薦的瓊脂稀釋法進(jìn)行。磷霉素受試濃度為0.125～256 mg / L，甲氧芐啶-磺胺甲唑（1∶19）受試濃度分別為0.004 / 0.076～8 / 152 mg / L，氨芐西林-舒巴坦（2∶1）受試濃度為0.06 / 0.03～128 / 64 mg / L，其他抗菌藥物受試濃度分別為0.06～128 mg / L，細(xì)菌的接種菌量為104cfu / 點(diǎn)，設(shè)置無抗菌藥物對照生長平皿。35 ℃?18～24 h培養(yǎng)后，肉眼觀察細(xì)菌生長，讀取結(jié)果。要求無抗菌藥物對照生長平皿上受試菌生長良好，受試藥對質(zhì)控菌株的MIC值處在質(zhì)控要求范圍。MIC值定義為未見細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為抗菌藥物對細(xì)菌的MIC值。

表1 PCR引物序列和擴(kuò)增片段Table 1 Primers and the amplication conditions of PCR used in this study

1.2.2 結(jié)果判斷 按照2014年版CLSI[10]的標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。苯唑西林的MIC值≥4 mg / L者即判斷為MRSA；去甲萬古霉素、氨芐西林-舒巴坦、頭孢唑林和磷霉素2014年版CLSI中沒有判斷標(biāo)準(zhǔn)，故僅作描述，不作結(jié)果判斷。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用WHONET 5.6軟件進(jìn)行藥敏數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 MRSA的DNA模板制備 按文獻(xiàn)[11]描述挑取1～2個(gè)純分的新鮮MRSA菌落，置于含200 μL TE緩沖液（pH8.0）的5 mL eppendorf管中；混勻，加入溶葡萄球菌素（20 U / mL）10 μL，37 ℃水浴放置30 min以上；然后于干熱器100℃加熱20 min，-40℃冰箱中快速冷卻10 min；再進(jìn)行12 000 r / min，5 min離心；所得上清液即為金葡菌DNA模板。

1.2.5 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件 預(yù)變性94℃，5 min；循環(huán)條件：94℃，30 s 、51℃（mecA） / 50℃（mecC）/ 53℃（PVL） / 51℃（sasX），30 s、72℃，50 s ，循環(huán)35次；延伸72℃，5 min；保存4℃。

2 結(jié)果

2.1 MRSA的檢出率

2.1.1 苯唑西林耐藥株的檢測 258株金葡菌經(jīng)苯唑西林瓊脂稀釋法檢測，其中對苯唑西林耐藥者（MICOXA≥4 mg / L）140株，為MRSA株，占54.3 %（140 / 258）；另118株為MSSA。歷年血液、腦脊液等無菌體液中金葡菌對苯唑西林耐藥株檢出率見表2。血液標(biāo)本中苯唑西林耐藥株占48.2 %（40.0%～63.2%），在腦脊液中占65.0 %，在胸腹水等其他無菌體液中占79.5 %（50.0%～93.8%）。

[n/n （%）]

表2 歷年苯唑西林耐藥株檢出率Table 2 Prevalence of the staphylococcal strains reistant to oxacillin in different 3-year periods

2.1.2 mecA和mecC基因的PCR檢測 采用mecA和mecC基因的PCR引物分別對90株臨床分離的MRSA株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳顯示90株MRSA均未檢測到mecC基因；90株MRSA 100 %顯示具有mecA基因的PCR擴(kuò)增陽性條帶，見圖1。

2.2 MRSA中殺白細(xì)胞毒素（PVL）和sasX基因的PCR檢測

運(yùn)用PVL和sasX基因的PCR引物分別對90株臨床分離的MRSA株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳顯示90株MRSA均未檢測到PVL基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；42株MRSA具有sasX基因的PCR擴(kuò)增陽性條帶，見圖2，檢出陽性率占

46.7 %（42 / 90）。

圖1 MRSA臨床株mecA基因PCR擴(kuò)增圖Figure 1 PCR amplifcation of mecA gene in clinical MRSA strains

2.3 抗菌藥物對金葡菌的MIC

2.3.1 MRSA和MSSA MRSA對多種受試抗菌藥物的耐藥率均高于MSSA，見表3。其不但對受試的β內(nèi)酰胺類高度耐藥，而且對受試的非β內(nèi)酰胺類如慶大霉素、阿米卡星和左氧氟沙星等抗菌藥物也呈現(xiàn)耐藥，耐藥率可達(dá)48 %或以上；但仍有75 %以上的MRSA對利福平和甲氧芐啶-磺胺甲唑敏感。MSSA對受試的β內(nèi)酰胺類高度敏感，除青霉素外，苯唑西林、氨芐西林-舒巴坦和頭孢唑林對MSSA的MIC50和MIC90均≤1 mg / L。MSSA對受試的非β內(nèi)酰胺類亦十分敏感，耐藥率均≤11 %。磷霉素對MRSA的MIC50和MIC90均＞256 mg / L，但對MSSA的MIC50和MIC90分別為2 mg / L和16 mg / L。在MRSA和MSSA中均未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺耐藥株。

圖2 MRSA臨床株sasX基因PCR擴(kuò)增圖Figure 2 PCR amplifcation of sasX gene in clinical MRSA strains

2.3.2 sas X基因陽性和陰性MRSA sasX基因陽性和陰性的MRSA對β內(nèi)酰胺類抗生素、磷霉素和左氧氟沙星均高度耐藥，但兩類MRSA對慶大霉素、阿米卡星、利福平和甲氧芐啶-磺胺甲唑顯示不一樣的耐藥率，見表4。其中sasX陽性MRSA對阿米卡星和甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率均顯著高于sasX陰性株（100 %對27.1 %；64.3 %對6.2 %；P＜0.01），對慶大霉素的耐藥率略高于sasX陰性MRSA（100 %對87.5 %；P ＜0.05）；但對利福平的耐藥率：sasX陽性MRSA略低于sasX陰性MRSA（0 對16.7 %；P ＜0.05）。

表3 抗菌藥物對金葡菌的體外抗菌活性Table 3 In vitro activities of antimicrobial agents against Staphylococcus aureus strains

表4 抗菌藥物對sasX陽性和sasX陰性MRSA的體外抗菌活性Table 4 In vitro activities of antimicrobial agents against sasX-positive and sasX-negative MRSA strains

3 討論

金葡菌可引起皮膚軟組織、骨感染和肺炎等感染性疾病，也是引起醫(yī)療機(jī)構(gòu)相關(guān)血流感染的重要病原菌之一[11]。甲氧西林用于臨床后不久， 1961年即出現(xiàn)首株MRSA[12]。50余年以來，MRSA在世界范圍內(nèi)流行，造成耐藥問題日益嚴(yán)重，引起廣泛關(guān)注。2013年CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)[13]的報(bào)道中金葡菌的檢出率為9.61 % ，占全年分離細(xì)菌的第5位；其在革蘭陽性菌中居首位。其中MRSA的檢出率占金葡菌的45.2 %。

本組資料顯示血液、腦脊液和胸腹水等無菌體液中的MRSA總檢出率為54.3 %。如以4年為一時(shí)間段，相比較每個(gè)時(shí)間段的MRSA檢出率，1999－2002年和2003－2006年分別為70 %和71.9 %， 至2007－2010年 和2011－2014年，MRSA的檢出率分別為51.3 %和43.7 %，顯示血液、腦脊液和胸腹水等無菌體液中MRSA的檢出率在逐年下降。這與國內(nèi)外有關(guān)MRSA檢出率顯示有逐年下降的趨勢相一致[14-18]。如2012年歐洲報(bào)道MRSA的檢出率由2002年的40 %～45 %下降至2010年的15 %～20 %[14]。CHINET 2016年報(bào)道[15]在2005－2014年的10年監(jiān)測中MRSA檢出率從2005年的69 %下降至2014年的42.5 %；血液標(biāo)本中MRSA的檢出率也從2010年的51.1 % 下降至2011的42.5 %[16-17]；腦脊液標(biāo)本中MRSA的檢出率也由2005年金葡菌中的82.1 %逐年下降到2007年的72.0 %[18]。上述標(biāo)本中分離檢出的MRSA對臨床常用的β內(nèi)酰胺類和非β內(nèi)酰胺類抗菌藥物均非常耐藥，但對甲氧芐啶-磺胺甲唑和磷霉素的耐藥率較低。除青霉素外，MSSA對β內(nèi)酰胺類抗生素仍很敏感，MIC90值均≤1 mg / L。本組資料未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素（包括去甲萬古霉素）、替考拉寧和利奈唑胺耐藥的菌株。這與CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測資料一致[13，15-18]。

金葡菌可產(chǎn)生一種特殊的PBP 2a，由mecA基因編碼，經(jīng)轉(zhuǎn)座子攜帶并整合至葡萄球菌染色體的mec部位[19]。故凡在金葡菌中檢測到mecA基因者，即為MRSA株。本組資料中受試檢測的90株MRSA均攜帶有mecA基因。

2011年英國Garcia-Alvarez等[3]報(bào)道在2007年的英國奶牛乳腺炎調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在一些對苯唑西林和頭孢西丁均耐藥的MRSA菌株中mecA基因和PBP2a均為陰性 。PCR測定在這些MRSA中可檢測到與mecA基因的同源性高達(dá)70 %的耐藥基因，被命名為mecALGA251基因 。該研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)對庫存金葡菌進(jìn)行了mecALGA251基因篩選。在1株1975年分離自患者的金葡菌中也發(fā)現(xiàn)具有相同的基因型。由此表明mecALGA251基因存在于金葡菌中已有近40年的時(shí)間，并且很可能來源于人類菌株。2012年國際葡萄球菌SCC盒式染色體分型工作組建議[20]將mecALGA251基因命名為mecC基因。本組資料顯示受試檢測的90株MRSA中未發(fā)現(xiàn)mecC基因。由于mecC基因陽性的MRSA目前僅在歐洲報(bào)道，推測此基因的檢出存在地域差異；亦有可能是PCR的引物或者擴(kuò)增條件不夠完善，需繼續(xù)改進(jìn)檢測方法。如果微生物實(shí)驗(yàn)室檢測到苯唑西林或頭孢西丁耐藥的MRSA，而PCR測定其mecA基因?yàn)殛幮詴r(shí)，需考慮mecC基因存在的可能。

PVL是金葡菌產(chǎn)生的一種細(xì)胞外毒素，由LukS-PV（S組份）和LukF-PV（F組份）兩個(gè)基因編碼共同轉(zhuǎn)錄[21]。PVL可損傷細(xì)胞膜，使細(xì)胞溶解，引起感染進(jìn)一步擴(kuò)散。余方友等[22]報(bào)道溫州地區(qū)來自不同標(biāo)本分離的MRSA中，PVL檢出率為15.7 %（19 / 121）。本組資料中90株分離自血液、腦脊液等無菌體液標(biāo)本的MRSA中未檢測到PVL陽性株。而余方友等[22]檢出具有PVL基因的菌株大多分離自膿液或創(chuàng)面分泌物和痰液標(biāo)本，推測金葡菌中PVL的檢出可能與標(biāo)本來源有關(guān)，同時(shí)可能有地域和醫(yī)療機(jī)構(gòu)的分布差異。

sasX基因于2012年首次發(fā)現(xiàn)于金葡菌中[4]，為一種細(xì)胞壁錨定蛋白編碼基因。sasX基因主要存在于醫(yī)院環(huán)境內(nèi)致病性的金葡菌中，這些臨床分離的金葡菌可能通過獲得sasX基因更加適應(yīng)醫(yī)院環(huán)境，造成醫(yī)院內(nèi)持續(xù)感染；而在正常人鼻腔中定植的金葡菌中sasX基因的陽性率僅為0.59 %。本組資料顯示90株臨床分離的MRSA中，sasX基因陽性的MRSA高達(dá)46.7 %，并對多種非β內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率均高于sasX基因陰性的MRSA，此與杜昕等[23]報(bào)道是一致的。

甲氧西林耐藥葡萄球菌仍然是目前臨床上的嚴(yán)重問題[1]。2015年美國CDC曾報(bào)道2002－2015年底已發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥金葡菌（VRSA）14株[24]、萬古霉素中介金葡菌（VISA）和異質(zhì)性萬古霉素中介金葡菌（hVISA）均已在世界各地報(bào)道[1]，這些萬古霉素耐藥的菌株為革蘭陽性菌中的廣泛耐藥（XDR）菌株[25]。有效治療藥物除利奈唑胺、頭孢洛林（國內(nèi)還未上市）外，臨床上并不多。本組資料雖未發(fā)現(xiàn)VRSA以及VISA等菌株，但仍需重視對我國金葡菌中MRSA的監(jiān)測，密切關(guān)注VRSA 、hVISA 和VISA等菌株的出現(xiàn)，更需重視血液、腦脊液和胸腹水等無菌部位標(biāo)本中的MRSA檢出。

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In vitro antimicrobial susceptibility and virulence genes of the Staphylococcus aureus strains isolated from blood and sterile body fuids

GUO Yan, WU Shi, FU Zhuyingjie, YANG Yang, HU Fupin, ZHU Demei. （Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China）

ObjectiveTo investigate the antimicrobial susceptibility and associated virulence genes of the Staphylococcus aureus strains isolated from blood, cerebrospinal fuid and other sterile body fuids in Huashan Hospital from year 1999 to 2014.MethodsMIC values of vancomycin and other antibiotics against S. aureus were measured by agar dilution method. Resistant genes mecA and mecC and virulence genes PVL and sasX were detected by PCR in the S. aureus strains.ResultsThe overall prevalence of MRSA in S. aureus was 54.3 % (140 / 258) and 45.7 % (118 / 258) for MSSA. Resistance rates of MRSA to most antimicrobial agents were higher than MSSA. MSSA strains were still sensitive to all the antibiotics tested, resistance rate not higher than 11 % except penicillin. MIC90values of β-lactam antibiotics (except penicillin) to MSSA were lower than 1 mg / L. No staphylococcal strains were found resistant to vancomycin, teicoplanin or linezolid. The mecA gene was present in all the 90 MRSA strains, and sasX gene in 46.7 % of the strains. The prevalence of MRSA isolated from blood, cerebrospinal fuid and other sterile body fuids decreased year by year. No mecC gene or PVL gene was identifed in these MRSA strains. Both sasX-positive MRSA and sasX-negative MRSA were resistant to β-lactam antibiotics, fosfomycin and levofoxacin. The sasX-positive MRSA strains showed higher resistance rates to amikacin and trimethoprim-sulfamethoxazole than sasX-negative MRSA.ConclusionsThe MRSA strains isolated from blood, cerebrospinal fuid and other sterile body fuids in Huashan Hospital were resistant to most commonly used anbiotics. MRSA surveillance is critical for rational use of antimicrobial agents.

Staphylococcus aureus; sterile body fuid; antimicrobial susceptibility

R378.11

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0127-07

10.16718/j.1009-7708.2017.02.002

2016-06-03

2016-08-05

國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2012ZX09303004-001）。

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，衛(wèi)生部抗生素臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040。

郭燕（1982—），女，碩士，主管技師，主要從事新抗菌藥物藥效學(xué)和細(xì)菌耐藥性研究。

朱德妹，E- mail：zhu_dm@fudan.edu.cn。