劉華，薛娟，唐振球，吳高松，王知斌，王秋紅，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥研究

關(guān)黃柏對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

劉華，薛娟，唐振球，吳高松，王知斌，王秋紅，匡海學(xué)*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的:研究關(guān)黃柏對(duì)對(duì)乙酰氨基酚(APAP)誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法:采用對(duì)乙酰氨基酚所致大鼠急性肝損傷模型，給藥24 h后檢測(cè)大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP);留取肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察肝臟組織病理變化;制備肝勻漿，測(cè)定肝中還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量。結(jié)果:與空白組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST和ALP活性明顯升高，肝臟組織出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞變性壞死;與模型組相比，不同濃度的關(guān)黃柏可以明顯降低小鼠血清中ALT、AST和ALP的活性，降低肝組織中MDA的含量，升高GSH的含量，肝組織病理?yè)p傷也明顯減輕。結(jié)論:關(guān)黃柏對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

關(guān)黃柏;對(duì)乙酰氨基酚;急性肝損傷

關(guān)黃柏為蕓香科植物黃檗的干燥樹(shù)皮。性苦、寒，歸腎、膀胱經(jīng)。具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡功效。用于濕熱瀉痢，黃疽尿赤，帶下陰癢等［1］，具有抗菌、抗真菌、鎮(zhèn)咳、抗肝炎、抗?jié)円约懊庖咭种频人幚碜饔茫?-3］。對(duì)于對(duì)乙酰氨基酚造成肝損傷，普遍認(rèn)為原因是由于其在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)生了大量的氧自由基等毒性代謝產(chǎn)物，與細(xì)胞膜結(jié)合產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，肝細(xì)胞抗氧化能力下降，進(jìn)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷［4］。本研究主要是通過(guò)對(duì)乙酰氨基酚導(dǎo)致的急性肝損傷模型來(lái)研究關(guān)黃柏對(duì)對(duì)乙酰氨基酚引起的急性肝損傷的保護(hù)作用，為找到對(duì)乙酰氨基酚肝損傷的臨床解毒劑提供依據(jù)。

1 材料與動(dòng)物處理

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

所選用的關(guān)黃柏購(gòu)買于哈爾濱世一堂藥店，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室蘇連杰教授鑒定為蕓香科植物黃檗的干燥根皮。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

考馬斯亮藍(lán)染料G250(Amesco);雙蒸水(本實(shí)驗(yàn)室采用MilliQ純水儀制備);MDA、GSH、ALT、AST、ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所);菜卡2135型切片機(jī)(德國(guó));Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國(guó));電熱恒溫箱(上海);羅氏cobas c311全自動(dòng)生化分析儀(瑞士);Thermo Scientific Evolution 260 Bio紫外分光光度儀(美國(guó));HITACHI高速離心機(jī)(日本)。

1.3 中藥水煎液的制備

按臨床常用方法對(duì)藥物進(jìn)行處理。稱取定量的上述藥材，加入10倍量水，浸泡60 min，快速加熱至沸騰，煎煮60 min，傾出藥液，殘?jiān)偌尤?倍水，煎煮提取60 min。合并2次藥液，濾過(guò)，黃柏濃縮至含生藥量為1 g/mL的中藥水提液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

雌性SD大鼠36只，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，置于動(dòng)物飼養(yǎng)籠中，保持室內(nèi)溫度18～22℃，室內(nèi)晝夜自然明暗交替照明，飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料。將大鼠隨機(jī)分為6組，分別為:空白對(duì)照組、聯(lián)苯雙脂陽(yáng)性藥組(0.3 g/kg)、模型組、關(guān)黃柏高劑量組(280 mg/kg)、中劑量組(140 mg/kg)、低劑量組(70 mg/kg)，每組6只。大鼠在鼠籠里適應(yīng)7天后，空白組給予生理鹽水，連續(xù)灌胃(每 100 g體質(zhì)量1 ml)15天最后1次給藥30 min后，除正常對(duì)照組其余各組均皮下注射對(duì)乙酰氨基酚(450 mg/kg)制備大鼠急性肝損傷模型。各組飼養(yǎng)過(guò)程中保持溫度、光照、濕度等環(huán)境條件均衡，自由進(jìn)食飲水。

2.2 樣品制備

各給藥組連續(xù)誘導(dǎo)15天后，實(shí)驗(yàn)取材前一天晚8點(diǎn)大鼠禁食不禁水，次日上午SD大鼠腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉麻醉(每100 g體質(zhì)量0.15 ml)，迅速打開(kāi)腹腔，腹腔采血，從門靜脈注射冰冷的生理鹽水，清除殘留血液，取出肝臟，用冰冷緩沖液洗凈，去除肝臟表面的血液，用濾紙吸干表面液體，切成0.5～1.0 cm3大小，用10%中性福爾馬林固定，以使固定液能迅速而均勻地滲入組織內(nèi)部，常規(guī)石蠟制片，HE染色，光鏡觀察。

2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)

取分離好的血清，采用羅氏Cobas c311全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)。

2.4 檢測(cè)肝臟中GSH和MDA的含量

按照實(shí)驗(yàn)方法學(xué)上組織勻漿的制備:稱取一定量的肝臟組織，按照肝臟組織重量(g):體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積0.9%的生理鹽水，在冰上進(jìn)行研磨，制備成10%的勻漿液，3 000 r/min，離心10 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。取10%的勻漿液500 μL根據(jù)試劑盒法對(duì)谷胱甘肽(GSH)含量進(jìn)行測(cè)定。在420 nm的吸光度進(jìn)行測(cè)定，單位為mg/g。取10%的勻漿液100 μL，采用TBA(硫代巴比妥酸)在532 nm處測(cè)定MDA的含量，單位為μmol/g。GSH和MDA及蛋白質(zhì)含量測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 生化指標(biāo)

關(guān)黃柏對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致大鼠血清ALP、ALT和AST中的影響結(jié)果見(jiàn)圖1(A-C)。肝臟是最大的解毒器官，ALT主要存在于肝臟、心臟和骨骼肌中，AST作為重要的轉(zhuǎn)氨酶之一，臨床上是肝功能檢查的指標(biāo)，主要用來(lái)判斷肝臟是否受到損傷。主要分布在心、肝、腎和骨骼肌中。ALT和AST是肝內(nèi)的主要功能酶，在肝細(xì)胞或者組織損傷及壞死時(shí)，肝細(xì)胞膜通透性增加，轉(zhuǎn)氨酶從細(xì)胞內(nèi)溢入血液，使得血清相關(guān)轉(zhuǎn)氨酶的水平顯著升高。ALP是一組催化磷酸單酯水解的酶類，分布范圍比較廣，主要存在肝臟、骨骼、腎臟等組織中，是從肝臟經(jīng)膽汁排泄的一種酶。中藥導(dǎo)致肝毒性時(shí)，使膽汁排泄受到抑制，造成血清ALP升高。臨床上ALT、ALP和AST是肝毒性的重要指標(biāo)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比較，模型組血清ALT、AST和ALP均顯著升高，具有顯著差異(P＜0.01)。不同濃度黃柏及陽(yáng)性藥可以顯著降低模型組的大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶，具有極顯著差異(P＜0.01)。其中高濃度關(guān)黃柏作用最強(qiáng)，表現(xiàn)出較好的保肝效果。

表1 各組ALT、AST、ALP水平比較(±s，n=6)

表1 各組ALT、AST、ALP水平比較(±s，n=6)

注:與空白組相比，*P＜0.01;與模型組相比，＊＊P＜0.01。

組別ALT AST ALP正常組18.96±4.96 58.23±8.12 43.13±6.11模型組 62.06±9.54*84.12±10.07*79.12±9.04*陽(yáng)性藥組 28.57±6.32＊＊60.42±7.16＊＊59.67±7.29＊＊低劑量組 30.09±7.12＊＊60.72±7.25＊＊48.87±6.11＊＊中劑量組 27.45±5.12＊＊48.97±5.21＊＊44.34±5.38＊＊高劑量組 20.62±4.11＊＊48.17±6.09＊＊39.92±6.20＊＊

3.2 對(duì)大鼠肝組織還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的影響

關(guān)黃柏對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致大鼠肝組織GSH和MDA的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。GSH是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化劑和自由基清除劑，主要的功能是清除自由基、抗衰老、抗氧化。具體機(jī)制是與自由基、重金屬等結(jié)合，使機(jī)體內(nèi)有毒的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的物質(zhì)，排出體外，同時(shí)對(duì)抗自由基對(duì)臟器組織的損害，保護(hù)肝細(xì)胞［5］。實(shí)驗(yàn)研究表明，與空白組比較，模型組GSH含量降低，具有顯著差異(P＜0.01)。與模型組比較，不同濃度的關(guān)黃柏組可以顯著地提高 GSH水平，具有顯著差異(P＜0.01)，說(shuō)明關(guān)黃柏能保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。關(guān)黃柏可通過(guò)升高肝臟GSH水平有效的減輕或消除對(duì)氨基酚肝臟毒性、改善肝細(xì)胞壞死程度。

圖1 血清ALP(A)，ALT(B)和AST(C)在各實(shí)驗(yàn)組大鼠的活性(n=6)

在生物體內(nèi)，MDA是自由基氧化的最終產(chǎn)物之一，MDA增多能加劇膜的損傷，可引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。因此在肝損傷中MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過(guò)MDA含量了解過(guò)氧化的程度［6-8］，以間接測(cè)定損傷程度。實(shí)驗(yàn)研究表明，與空白組比較，模型組MDA含量升高，具有顯著差異(P＜0.01)。與模型組比較，黃柏能顯著地降低MDA水平，具有顯著差異(P＜0.01)。其中關(guān)黃柏組與空白組比較MDA降低，有顯著性差異(P＜ 0.01)，GSH水平升高，具有顯著差異(P＜0.01)。

表2 各組GSH、MDA水平比較(±s，n=6)

表2 各組GSH、MDA水平比較(±s，n=6)

注:與空白組相比，*P＜0.01;與模型組相比，＊＊P＜0.01。

組別GSH MDA正常組6.38±1.01 2.01±0.41模型組 3.73±0.50*4.41±0.86*陽(yáng)性藥組 6.35±1.16＊＊2.24±0.62＊＊低劑量組 6.44±1.05＊＊2.52±0.67＊＊中劑量組 6.53±1.03＊＊2.34±0.77＊＊高劑量組 6.97±1.24＊＊2.26±0.62＊＊

圖2 肝組織中GSH，MDA在各實(shí)驗(yàn)組大鼠的活性(n=6)

3.3 肝組織細(xì)胞的病理學(xué)變化

光鏡下觀察空白組肝細(xì)胞排列整齊，沒(méi)有出現(xiàn)脂肪樣變性，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，沒(méi)有發(fā)生病理改變(圖3-A)。模型組肝細(xì)胞間間隙有大量炎癥細(xì)胞，肝組織可見(jiàn)局部點(diǎn)狀、片狀水腫變(圖3-B)。陽(yáng)性藥及不同濃度的關(guān)黃柏可改善對(duì)對(duì)氨基酚引起的大鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)變化，陽(yáng)性藥及低、中、高濃度的關(guān)黃柏對(duì)肝臟病理?yè)p害改善較為明顯(圖3C～F)。

圖3 不同組別的HE染色病理切片圖(×400)

4 討論

對(duì)乙酰氨基酚是建立肝損傷的常用模型藥物，而血清學(xué)指標(biāo)ALT，AST，ALP是反應(yīng)肝實(shí)質(zhì)損害的常見(jiàn)的主要酶學(xué)指標(biāo)，所以本實(shí)驗(yàn)選用對(duì)乙酰氨基酚作為造模藥物，用ALT，AST，ALP作為判斷肝損傷的程度［9］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，模型組小鼠血清的3個(gè)酶學(xué)指標(biāo)均顯著增高，表明小鼠肝臟受到損害，肝損傷模型是成功的。而給予不同濃度的關(guān)黃柏小鼠的酶學(xué)指標(biāo)均顯著降低，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。經(jīng)過(guò)檢測(cè)肝功能指標(biāo)和病理結(jié)果表明，關(guān)黃柏具有明顯的減毒效果，隨著濃度增加，效果更加明顯肝臟是最大的解毒器官，體內(nèi)的代謝及去除毒素都在肝臟中完成，因而肝臟易受多種有害因素攻擊。肝損傷主要是由于細(xì)胞膜的氧化損傷或生物轉(zhuǎn)化異常導(dǎo)致［10］，對(duì)乙酰氨基酚具有抑制肝臟中的GST，升高M(jìn)DA的活性，說(shuō)明其毒性作用的產(chǎn)生與抗氧化酶相關(guān)。關(guān)黃柏對(duì)對(duì)乙酰氨基酚造成的肝損傷具有保護(hù)作用，能減輕肝細(xì)胞壞死，防止纖維化和脂肪變性，同時(shí)可以提高肝臟內(nèi)GSH和降低MDA活性，能保護(hù)對(duì)氨基酚引起的肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，提高肝細(xì)胞存活率，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化作用。

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Protective Effect of Phellodendri Amurensis Cortex on Acetaminophen-induced Acute Hepatic Injury in Rats

LIU Hua，XUE Juan，TANG Zhen-qiu，WU Gao song，WANG Zhi-bin，WANG Qiu-hong，KUANG Hai-xue*
(Key Laboratory of Chinese Materia Medica(Ministry of Education)，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To investigate the protective effect of Phellodendri Amurensis Cortex on acetaminopheninduced acute hepatic injury in rats.Methods:Liver injury models were induced by subcutaneous injection of acetaminophen.Twenty-four hours later，the activities of serum alanine aminotransferase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)and alkaline phosphatase(ALP)were determined，and the liver tissues were collected for histopathological assessment by HE staining under light microscope.The contents of glutathione(GSH) and malondialdehyde(MDA)in liver homogenate were also measured.Results:Compared with the normal control group，the model group could markedly increase serum ALT，AST and ALP activities，and the degeneration and necrosis could be observed in liver tissues.Compared with the model group，Phellodendri Amurensis Cortex could markedly decrease serum ALT，AST and ALP activities，reduce the MDA level in liver homogenate，and increase the content of GSH in the liver homogenate.The hepatic histopathological changes in liver were also significantly ameliorated.Conclusion:The Phellodendri Amurensis Cortex can prevent the liverfrom acetaminophen-induced acute hepatic injury.

Phellodendri Amurensis Cortex;Acetaminophen;Acute hepatic injury

R285.6

A

1002-2406(2017)02-0001-04

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973)項(xiàng)目(No.2013CB531801);國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81473351)

劉華(1990-)，男，碩士研究生，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。

匡海學(xué)*(1955-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥性味理論和中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。

2016-07-19

修回日期:2016-08-01