王小亮　賈麗　王靜波　王姝　曹歡　張文　徐立蒲

摘要：為摸清淡水魚類最主要的致病菌——嗜水氣單胞菌對(duì)國家批準(zhǔn)使用的新獸藥——氟苯尼考的耐藥性的獲得與消失速率，提供科學(xué)使用該藥的數(shù)據(jù)支撐，測(cè)定在低濃度的氟苯尼考?jí)毫ο拢?株嗜水氣單胞菌對(duì)氟苯尼考的最小抑菌濃度（MIC）隨時(shí)間的變化，以及3株菌對(duì)氟苯尼考的耐藥性獲得速率和消失速率。結(jié)果表明，菌株在低濃度的氟苯尼考下，4～5 d其耐藥濃度升高1.6～2.5倍。同時(shí)，菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥濃度隨著藥物濃度的逐漸增加可迅速上升15.9～40倍，但其消失較慢，28 d的消失速率為1.58～2.54。因此， 在使用氟苯尼考防治細(xì)菌性疾病時(shí)，連用時(shí)間不宜超過4 d，再次使用的間隔不少于28 d。

關(guān)鍵詞：嗜水氣單胞菌；氟苯尼考；耐藥性

中圖分類號(hào)：S948

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

當(dāng)前，防治嗜水氣單胞菌性疾病的主要手段是使用化學(xué)藥物[1]。然而，我國對(duì)魚類的抗菌藥物的藥效學(xué)及藥物代謝動(dòng)力學(xué)等基礎(chǔ)研究的薄弱，加上養(yǎng)殖者輕預(yù)防重治療，不針對(duì)病原的盲目用藥和未進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)的濫用魚藥，導(dǎo)致嗜水氣單胞菌耐受的抗菌藥物種類日益增多，對(duì)抗菌藥物的耐受劑量越來越強(qiáng)。目前，嗜水氣單胞菌對(duì)上世紀(jì)60年代開始使用的磺胺類藥物敏感率不足20%[2]，對(duì)上世紀(jì)80年代開始使用的喹諾酮類藥物的敏感率已從100%下降到40%～60%[3]。

氟苯尼考又稱氟甲砜霉素，是一種新型的動(dòng)物專用的氯霉素類廣譜抗生素。20世紀(jì)80年代末研制而成，1990年在日本首先用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，之后在世界范圍內(nèi)廣泛上市。我國于1999年批準(zhǔn)氟苯尼考為國家二類新獸藥，最早用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上治療鰻鱺愛德華氏菌病和赤鱗病[4]，目前，已在水產(chǎn)業(yè)廣泛應(yīng)用，主要用于防治魚類的各種細(xì)菌性疾病。為避免氟苯尼考重蹈磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的覆轍，本文開展嗜水氣單胞菌對(duì)氟苯尼考的耐藥性獲得和消失速率研究，為科學(xué)規(guī)范氟苯尼考的使用提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

3株嗜水氣單胞菌菌株為2013年5月從北京懷柔發(fā)病的養(yǎng)殖鱘魚上分離獲得，純化后經(jīng)API鑒定系統(tǒng)和16S rDNA鑒定為嗜水氣單胞菌，分離部位分別為肝、脾、腎，編號(hào)1、2、3。Mulluer-Hinton肉湯（MHB）購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，腦心浸液瓊脂（BHIA）購于英國OXOID公司。氟苯尼考購于美國Sigma公司，用甲醇溶解后，用蒸餾水稀釋，制備濃度為2 560 μg/mL，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾除菌后，作為母液備用。

1.2方法

1.2.1菌株最小抑菌濃度的測(cè)定采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）推薦的濃度稀釋法（NCCLS，2010）。操作方法為：菌株接種至BHIA平板，置于28 ℃培養(yǎng)16～20 h后，采用045%無菌生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，稀?00倍備用。使用母液和無菌MHB培養(yǎng)基制備氟苯尼考濃度梯度，濃度分別為0.5 μg/mL、0.8 μg/mL、1.3 μg/mL、2.0 μg/mL、3.2 μg/mL、5.0 μg/mL、8.0 μg/mL、12.7 μg/mL、20.2 μg/mL、32.0 μg/mL，每管3.0 mL，每管加備用的菌懸液100 μL，無菌塞封口后于28 ℃培養(yǎng)48 h，記錄最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.2一定氟苯尼考濃度壓力下菌株MIC隨時(shí)間的變化制備氟苯尼考濃度為0.4 μg/mL滅菌MHB培養(yǎng)基，滅菌試管分裝成5 mL/管。每株菌接種9支試管，每管接種100 μL備用菌懸液。加滅菌塞子，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育，每天早、中、晚對(duì)試管搖勻。每天取一管，按1.2.1方法測(cè)定菌株的MIC值。

1.2.3菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥性獲得速率測(cè)定菌株的MIC后，從肉眼觀察有細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度的試管中吸取100 μL培養(yǎng)基，將其接種在不同氟苯尼考濃度的MHB培養(yǎng)基試管中，28 ℃孵育48 h；再從肉眼觀察有細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度的試管中吸取100 μL培養(yǎng)基，接種至不同氟苯尼考濃度的MHB培養(yǎng)基試管中，28 ℃孵育48 h。連續(xù)操作7次。使嗜水氣單胞菌在含有氟苯尼考的藥物培養(yǎng)基中傳代7次，比較最后測(cè)定的MIC與最初的MIC比較，評(píng)價(jià)菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥性獲得速率。

1.2.4菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥性消失速率將1.2.3選出的已獲得較高耐藥性的菌株，以瓊脂內(nèi)穿刺法將菌株分別接種在盛有不含氟苯尼考的BHIA培養(yǎng)基中，在4 ℃條件下保存，測(cè)定放置1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d后，菌株的MIC值。同時(shí)，采用不含氟苯尼考的BHIA平板傳代，連續(xù)傳代7次，測(cè)定每次傳代后菌株的MIC值。將菌株4 ℃放置28 d的MIC值及傳代7次后測(cè)定的MIC與最初的MIC比較，評(píng)價(jià)菌株對(duì)氟苯尼考耐藥性消除速率。

2結(jié)果

2.1一定濃度的氟苯尼考?jí)毫ο戮闙IC隨時(shí)間的變化規(guī)律

在一定濃度的氟苯尼考?jí)毫ο拢侥峥紝?duì)3株嗜水氣單胞菌的MIC均呈現(xiàn)先逐步上升之后穩(wěn)定的趨勢(shì)。經(jīng)0.4 μg/mL的氟苯尼考作用4～5 d，嗜水氣單胞菌對(duì)氟苯尼考的耐藥濃度升高2.0～2.5倍。見表1。

2.2菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥性獲得速率

3株嗜水氣單胞菌經(jīng)連續(xù)7次在帶有氟苯尼考的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥性變化情況見表2。由表2可以看出3株嗜水氣單胞菌在含有氟苯尼考的培養(yǎng)基中傳代7次后，均獲得了較強(qiáng)的耐藥性。3株嗜水氣單胞菌的MIC分別從0.8 μg/mL上升到了12.7 μg/mL、32.0 μg/mL和20.2 μg/mL，分別上升了15.9倍、40.0倍和25.3倍。

嗜水氣單胞菌對(duì)氟苯尼考的MIC隨放置時(shí)間和傳代次數(shù)的變化數(shù)據(jù)分別見表3、表4。數(shù)據(jù)表明，菌株對(duì)氟苯尼考的MIC值隨放置時(shí)間和傳代次數(shù)逐漸降低，表明菌株的耐藥性在逐漸消失。菌株放置28 d，MIC值分別由12.7 μg/mL、32.0 μg/mL、20.2 μg/mL下降至5.0 μg/mL、12.7 μg/mL、8.0 μg/mL。菌株傳代7次，MIC值分別下降至5.0 μg/mL、20.2 μg/mL、8.0 μg/mL。菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥性消失速率在1.58～254之間。

本文實(shí)驗(yàn)了低濃度的氟苯尼考?jí)毫ο碌氖人畾鈫伟退幮宰兓约熬陮?duì)氟苯尼考的耐藥性獲得速率和消失速率。在低濃度的氟苯尼考作用下4～5 d即可導(dǎo)致菌株的耐藥濃度升高1.6～2.5倍。這與Pallares等[5]發(fā)現(xiàn)低濃度的抗菌藥物與細(xì)菌長(zhǎng)期接觸會(huì)導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性和治療失敗觀點(diǎn)基本一致。同時(shí)，菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥濃度隨著藥物濃度的增加，7次即可上升15.9～40.0倍。氟苯尼考是濃度依賴型藥物，宜每日用藥1次。以上信息提示我們使用氟苯尼考治療疾病時(shí)，使用劑量需要用到殺菌濃度，使用時(shí)間不宜超過4 d，不然會(huì)導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥突變，疾病更難治療。在使用劑量如何用到殺菌濃度方面，李夢(mèng)影等[6]通過對(duì)氟苯尼考在鯽和草魚體內(nèi)的藥代/藥效動(dòng)力學(xué)聯(lián)合參數(shù)及臨床給藥方案的研究，建議氟苯尼考的給藥劑量為30 mg/kg。陳昌福教授依據(jù)日本學(xué)者研究的魚類病原菌的MIC與使用劑量的關(guān)系，建議給藥劑量為鯉科病魚分離菌的MIC乘以8.1。無論何種給藥劑量，只有充分了解病原菌的藥物感受性水平、藥物在魚體的藥代動(dòng)力學(xué)特性，完美結(jié)合兩者才能達(dá)到精準(zhǔn)藥效。

嗜水氣單胞菌對(duì)氟苯尼考的耐藥性消失速率較慢，28 d的下降速率為1.58～2.54。顯然，菌株一旦獲得較高的耐藥水平，自然恢復(fù)最初的耐藥水平則至少需要28 d。因此，為避免耐藥菌株產(chǎn)生，延長(zhǎng)藥物使用年限，兩次使用氟苯尼考的時(shí)間間隔至少在28 d以上才更為科學(xué)。

參考文獻(xiàn)：

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李愛華.水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的抗菌藥物及細(xì)菌耐藥性[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2002，9（1）：87-91

[2] 王小亮，徐立蒲，王靜波，等.北京市主要養(yǎng)殖魚類病原菌藥物敏感性分析[J].北京農(nóng)業(yè)，2012，（36）：79-81

[3] 王小亮，徐立蒲，曹歡，等.魚源病原菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（3）：195-199

[4] 張雷，張?bào)P，徐倩，等.氟苯尼考的毒性及殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志，2009，43（6）：49-52

[5] Pallares R，F(xiàn)enoll A，Linares J.The epidemiology of antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae and the clinical relevance of resistance to cephalosporins，macrolides and quinolones[J].International Journal of antimicrobial agents，2003，（22）：12-24

[6] 李夢(mèng)影，徐麗娟，呂利群.氟苯尼考在鯽和草魚體內(nèi)的藥代/藥效動(dòng)力學(xué)聯(lián)合參數(shù)及其臨床給藥方案的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014，38（6）：888-894

（收稿日期：2016-11-11）