葛 琨，武 運,*，楊保偉，吳浩天，王 威，張亞南，田 歌，馬文瑞

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

烏魯木齊牛羊肉源沙門氏菌對喹諾酮類藥物的耐藥狀況及相關(guān)基因分析

葛 琨1，武 運1,*，楊保偉2，吳浩天1，王 威1，張亞南1，田 歌1，馬文瑞1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

目的：研究牛羊肉源沙門氏菌對15 種抗生素的藥敏性以及對喹諾酮類藥物的相關(guān)耐藥基因，更好地了解沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播途徑，為預(yù)防與控制沙門氏菌疾病提供基礎(chǔ)信息。方法：用瓊脂稀釋法測定沙門氏菌的藥敏性，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和基因序列測定法確定耐藥沙門氏菌中與喹諾酮類抗生素耐藥相關(guān)的喹諾酮類抗性決定區(qū)基因突變及質(zhì)粒攜帶的耐藥基因。結(jié)果：30 株沙門氏菌中對甲氧芐啶、氯霉素、萘啶酮酸、四環(huán)素、磺胺異甲二唑、鏈霉素、甲氧嘧啶/磺胺異惡唑、阿莫西林、氨芐西林的耐藥率分別為100%、86.7%、66.7%、60.0%、50.0%、33.3%、26.7%、6.7%、6.7%，對環(huán)丙沙星、頭孢曲松、慶大霉素、卡那霉素、頭孢西丁、阿米卡星均表現(xiàn)為敏感；qnrB、qnrA、qnrS、aac(6′)-Ib-cr基因的檢出率分別為5.0%、45.0%、0%、5.0%；30 株沙門氏菌發(fā)生gyrA基因突變的菌株數(shù)為14 株，主要突變類型是Ser83Phe，發(fā)生parC基因突變的菌株數(shù)為25 株，主要突變類型是Thr57Ser。結(jié)論：烏魯木齊牛羊肉源沙門氏菌的耐藥情況較為嚴(yán)重，對喹諾酮類藥物的耐藥狀況應(yīng)當(dāng)予以關(guān)注，其耐藥突變基因及質(zhì)粒攜帶的耐藥基因在一定程度上是導(dǎo)致沙門氏菌耐藥的重要原因。

沙門氏菌；藥敏性；喹諾酮；耐藥基因

沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上有重要意義的人畜共患病之一，對人類和動物健康都具有極大威脅[1]。目前，由沙門氏菌引起的食源性疾病不僅成為全世界非常重視的公共衛(wèi)生問題，對全球食品安全和人類健康也造成了巨大威脅[2]。近年來，由于抗生素在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和臨床治療中廣泛使用甚至濫用，導(dǎo)致病原菌的耐藥性逐步增強，耐藥譜逐漸加寬，因此，加強該菌耐藥性檢測具有重要的公共衛(wèi)生意義[3-6]。

喹諾酮類藥物是人和動物的沙門氏菌性胃腸炎疾病的常規(guī)用藥，有時為讓動物快速生長，會將該類抗生素藥物伴隨飼料添加到動物的食物中，長時間后多種血清型沙門氏菌對喹諾酮類藥物的敏感性下降，導(dǎo)致多重耐藥性沙門氏菌越來越常見，因此了解沙門氏菌的耐藥機制對預(yù)防與控制沙門氏菌疾病有著重要意義[7-10]。

目前，國內(nèi)外研究者認(rèn)為，編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶A、B、C、D亞單位中任一亞基的基因發(fā)生突變均可引起喹諾酮類的耐藥性，其中DNA旋轉(zhuǎn)酶亞基GyrA和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ亞基ParC中的部分基因又是影響耐藥性的主要亞基基因。另外，有研究表明，導(dǎo)致沙門氏菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生抗性的另一原因是質(zhì)粒攜帶耐藥基因的轉(zhuǎn)移。許多耐藥質(zhì)粒含有多種耐藥基因，如qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib-cr質(zhì)粒基因，其廣泛存在于自然界中的許多細(xì)菌中，并且能在細(xì)菌之間相互傳播，導(dǎo)致沙門氏菌對喹諾酮類抗生素藥物的抗性不斷提高[11-12]。

本研究主要分析了30 株牛羊肉源沙門氏菌對15 種抗生素藥物的藥敏性情況，及喹諾酮相關(guān)耐藥基因，以更好地了解沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播途徑，為預(yù)防與控制沙門氏菌疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

沙門氏菌（Salmonella typhimurium），分離自2013—2014年采集于烏魯木齊地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場的325 份零售羊肉樣品（21 株）及210 份零售牛肉樣品（9 株）。沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LT2、藥敏實驗質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922和糞腸球菌ATCC29212均為西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

沙門氏菌屬O多價抗血清A-F 寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPmix、10×Buffer、DL2000 DNA Marker、DL100 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；氨芐西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林-克拉維酸（amoxicillin-clavulanic acid，AMC）、頭孢曲松（ceftriaxone，CRO）、頭孢西?。╟efoxitin，CEF）、氯霉素（chloramphenicol，CHL）、四環(huán)素（tetracycline，TET）、鏈霉素（streptomycin，STR）、阿米卡星（amikacin，AMK）、慶大霉素（gentamicin，GEN）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、磺胺甲基異惡唑-甲氧芐啶（sulfamethoxazole-trimethoprim，SXT）、磺胺二甲異唑（sulfadimethisoxazol，SMX）、甲氧芐啶（trimethoprim，TIO）、萘啶酮酸（nalidixic acid，NAL）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP） 美國Sigma公司。

1.1.3 PCR擴增引物

表1 PCR擴增基因與引物Table1 PCR primers for the target genes

qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib-cr、gyrA和parC基因擴增用引物均使用Primer Premier 5軟件設(shè)計，由上海捷銳生物工程有限公司合成（表1）。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；微波爐 廣州美的微波爐制造有限公司；隔水式培養(yǎng)箱 江蘇東鵬儀器制造有限公司；三用恒溫水箱 常州中捷實驗儀器制造有限公司；鼓風(fēng)干燥箱 寶康電器設(shè)備有限公司；超純水器 德國Eppendoff公司；4 ℃冰箱 海爾電器股份有限責(zé)任公司；-40 ℃低溫冰箱、-80 ℃超低溫冰箱日本三洋公司；高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；旋渦振蕩器 海門其林貝爾儀器制造有限公司；分析天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；磁力加熱攪拌器 美國Thermo Fisher公司；高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 藥敏性測定

對經(jīng)分離鑒定的沙門氏菌按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）推薦的瓊脂稀釋法測定抗生素的最小抑菌濃度，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果并確定耐藥表型進行耐藥性檢測[13]。藥敏測定中使用大腸埃希菌ATCC25922和糞腸球菌ATCC29212質(zhì)控菌株。

1.3.2 喹諾酮類抗生素相關(guān)耐藥基因檢測

1.3.2.1 沙門氏菌DNA提取

用無菌棉簽蘸取適量在LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)的沙門氏菌，將其均勻洗滌于無菌生理鹽水中，制成麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液，取800 μL菌懸液于1.5 mL無菌離心管中，100 ℃左右加熱煮沸10 min，13 200 r/min離心5～8 min后，吸取上清液，備用。

1.3.2.2 PCR擴增

PCR體系（25 μL）為：13.25 μL ddH2O、2.5 μL10×PCR Buffer、2.0 μL dNTP、1.5 μL MgCl2、0.25 μL Taq酶、上游引物、下游引物和5 μL DNA模板。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。不同基因擴增過程的退火溫度應(yīng)由相應(yīng)的引物序列來確定。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.3.2.3 DNA序列測定

gyrA和parC基因擴增產(chǎn)物由上海桑尼生物科技有限公司純化后測序。

1.3.2.4 gyrA、parC基因突變位點的確定

將測定得到的DNA序列輸入基因庫，采用軟件BLAST程序在線比對，在確定標(biāo)準(zhǔn)菌株Salmonella typhimurium LT2的DNA序列和基因庫序列完全吻合以后，比對分析供試菌株相應(yīng)的DNA序列，來確定突變點和突變的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏性結(jié)果

2.1.1 沙門氏菌對供試抗生素的藥敏性

由圖1可知，30 株沙門氏菌均對TIO有抗性，但對KAN、CRO、GEN、CEF、AMK和CIP均表現(xiàn)敏感，對其他供試抗生素的總耐藥率依次為CHL 86.7%、NAL 66.7%、TET 60.0%、SMX 50%、STR 33.3%、SXT 26.7%、AMP 6.7%、AMC 6.7%。在每一特定數(shù)量的抗生素譜系中，以4 種和5 種抗生素組成的耐藥譜種類最多（4 類），其次為2 種抗生素組成的耐藥譜（3 類）和3 種（2 類）、6 種（2 類）、7 種（2 類）及8 種（1 類）抗生素組成的耐藥譜。

圖1 牛羊肉源沙門氏菌對抗生素的耐藥率Fig.1 Antibiotic resistance of beef and mutton-borne Salmonella

2.1.2 牛羊肉源沙門氏菌的耐藥譜

表2 牛羊肉源沙門氏菌的耐藥譜和相應(yīng)菌株數(shù)Table2 Antimicrobial resistance prof i les of beef and mutton-borne Salmonella and corresponding numbers

由表3可知，30 株烏魯木齊地區(qū)牛羊肉源沙門氏菌中，同時對2～3 種抗生素產(chǎn)生抗性菌株數(shù)為8 株（占比26.6%），同時對4～5 種抗生素產(chǎn)生抗性菌株數(shù)15 株（50.0%），同時對6～7 種抗生素產(chǎn)生抗性菌株數(shù)為6 株（20.0%），同時對8 種抗生素產(chǎn)生抗性菌株數(shù)為1 株（3.3%）。

2.2 喹諾酮類抗生素耐藥相關(guān)gyrA、parC基因擴增及突變結(jié)果

由圖2、3可知，gyrA、parC基因的DNA大小分別為190 bp和270 bp。由表3可知，30 株沙門氏菌的gyrA、parC基因中共檢出39 個點突變，25 株（83.33%）沙門氏菌parC基因中發(fā)生的Thr57Ser變異為常見突變，在該位點，由于基因突變而使蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。14 株沙門氏菌gyrA基因突變株中，有11 株在83位氨基酸處發(fā)生突變，突變類型為Ser83Phe或Ser83Tyr。另外，有2 株在87位氨基酸處發(fā)生突變，突變類型為Asp87Tyr或Asp87Asn，只有1 株沙門氏菌突變類型為Gly75Phe。

圖 2gyrA基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplifi cation results of gyrA gene

圖 3parC基因PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplifi cation results of parC gene

表3 30 株沙門氏菌gyrA、parC 基因突變結(jié)果Table3 gyrAandparC mutations in 30Salmonella isolates

在20 株耐萘啶酮酸的菌株中，13 株檢測到gyrA與parC同時突變，2 株僅parC突變，3 株僅gyrA突變，gyrA和/或parC基因突變導(dǎo)致菌株耐萘啶酮酸的比例達90.0%。在25 株沙門氏菌parC基因突變株中，耐萘啶酮酸菌株為15 株（占比60.0%），在18 株沙門氏菌gyrA突變株中，耐萘啶酮酸菌株為16 株（占比88.89%）。

2.3 喹諾酮類抗生素耐藥相關(guān)質(zhì)粒基因檢出結(jié)果

圖4 qnrA基因PCR擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplifi cation results of qnrA gene

圖5 qnrB基因PCR擴增結(jié)果Fig.5 PCR amplifi cation results of qnrB gene

圖6 aac(6?)-Ib-cr基因PCR擴增結(jié)果Fig.6 PCR amplifi cation results of aac(6?)-Ib-cr gene

表4 牛羊肉源沙門氏菌相關(guān)質(zhì)?；驒z出結(jié)果Table4 Results of detection of plasmid-mediated quinolone resistance genes in beef and lamp-borne Salmonella

由圖4～6可知，通過PCR擴增基因產(chǎn)物進行電泳后得qnrA、qnrB、aac(6′)-Ib-cr基因的DNA大小分別為580、469、428 bp。由表4可知，20 株耐一代喹諾酮NAL的沙門氏菌菌株中，qnrB基因的檢出率最高，為45.0%，qnrA和aac(6′)-Ib-cr基因的檢出率均為5.0%，qnrS基因未檢出，qnrB質(zhì)?；虻臋z出率要明顯高于其他3 種質(zhì)?；?。其中羊肉源中沙門氏菌qnrA、qnrB基因的檢出率分別為5.0%、35.0%，qnrS、aac(6′)-Ib-cr基因均未檢出，而牛肉源中沙門氏菌qnrB、aac(6′)-Ib-cr基因的檢出率分別為10.0%、5.0%，qnrA、qnrS基因均未檢出。

3 討 論

沙門氏菌是目前最常見的食源性致病菌，我國每年大約有3 億人因沙門氏菌感染而患病，占我國病原菌型食源性疾病總數(shù)的70%～80%[13]。因此，為治療沙門氏菌性疾病，大量的抗生素藥物開始被使用，使沙門氏菌對許多抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性。從檢測結(jié)果來看，烏魯木齊地區(qū)牛羊肉源沙門氏菌對TIO（100%）、CHL（86.7%）、NAL（66.7%）、TET（60.0%）、SMX（50.0%）5 種抗生素的耐藥率均在50.0%以上，這可能源于這些抗生素在該地區(qū)牛羊肉生產(chǎn)過程中的廣泛使用致使細(xì)菌的耐藥性普遍偏高。NAL是應(yīng)用于治療沙門氏菌疾病的第1代喹諾酮類藥物[14]，本研究中牛羊肉源沙門氏菌分離株對NAL的耐藥程度比較嚴(yán)重，耐藥率高達66.7%，但對3代喹諾酮CIP完全敏感，這一結(jié)果與目前許多的研究結(jié)果是相一致的，這對掌握新疆烏魯木齊沙門氏菌的耐藥表型從而選擇相應(yīng)的應(yīng)對措施有著重要意義[15]。

目前，病原沙門氏菌染色體DNA中編碼解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ亞基上的氟喹諾酮類抗生素抗性決定區(qū)基因突變是國內(nèi)外研究認(rèn)為沙門氏菌對喹諾酮的耐藥的主要機制之一[16]，而編碼基因gyrA和parC又分別是解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ上發(fā)生突變的主要編碼基因。檢測結(jié)果表明，在20 株耐萘啶酮酸的菌株中，gyrA與parC編碼基因中有一種發(fā)生突變導(dǎo)致菌株耐萘啶酮酸的比例達到了90.0%，從突變結(jié)果上來看，gyrA編碼基因的突變類型主要是Ser83Phe，即83位的絲氨酸被苯丙氨酸替代，另外也有少部分其他的突變類型，如Ser83Tyr、Asp87Tyr、Asp87Asn、Gly75Phe；parC基因突變類型主要是是Thr57Ser，即57位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，這些突變類型也已經(jīng)被許多研究者證實[17]。

另外，編碼基因gyrA與parC的突變在導(dǎo)致菌株的耐藥程度上又存在差異[18]，在25 株檢測到parC發(fā)生突變的沙門氏菌菌株中，對NAL的產(chǎn)生抗性的菌株數(shù)為15 株，所占比例為60.0%，在18 株檢測到gyrA發(fā)生突變的沙門氏菌菌株中，對NAL產(chǎn)生抗性的菌株數(shù)為16 株，所占比例為88.9%，由此可以得出的結(jié)論是，編碼基因gyrA基因突變在一定程度上比parC基因突變更容易導(dǎo)致沙門氏菌對NAL產(chǎn)生抗性，這與現(xiàn)有的結(jié)論是一致的。對沙門氏菌進行耐喹諾酮類藥物相關(guān)基因的持續(xù)監(jiān)控是減少耐藥性產(chǎn)生的重要措施之一[19]。

導(dǎo)致沙門氏菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生抗性的另外一個機制是質(zhì)粒攜帶耐藥基因的轉(zhuǎn)移[20]。許多耐藥質(zhì)粒含有多種耐藥基因，它們廣泛存在于自然界中的許多細(xì)菌中，并且能在許多細(xì)菌之間相互傳播。目前，許多研究結(jié)果表明，qnrA與qnrB兩種質(zhì)?；蛟诖竽c桿菌等腸桿菌屬中均有檢出[21]，qnrS和aac(6′)-Ib-cr基因的相關(guān)研究報道還很少。本實驗檢測結(jié)果表明，在20株耐萘啶酮酸的沙門氏菌菌株中，qnrB基因的檢出率要明顯高于其他3 種質(zhì)?；?，共檢測出9 株（45.0%），qnrA和aac(6′)-Ib-cr基因的檢出數(shù)均為1 株（5.0%），qnrS基因未檢出，但由于樣本數(shù)量較小的原因，由此得出的結(jié)論與現(xiàn)有的研究結(jié)果并不完全一致，需要做進一步的調(diào)查研究。

沙門氏菌對一代喹諾酮的耐藥情況與攜帶耐藥基因的相關(guān)質(zhì)?；虻臋z出與否存在一定關(guān)系[22-24]，在檢出qnrA、qnrB、aac(6′)-Ib-cr質(zhì)?；虻?2 株沙門氏菌菌株中，對一代喹諾酮藥物NAL產(chǎn)生抗性的菌株數(shù)為10株，耐藥比例達到了83.33%，這說明，攜帶耐藥基因的相關(guān)質(zhì)粒在一定程度上可以導(dǎo)致沙門氏菌對一代喹諾酮藥物產(chǎn)生抗性。

本研究結(jié)果表明，新疆烏魯木齊地區(qū)牛羊肉源沙門氏菌對常用抗生素藥物的耐藥情況較為嚴(yán)重，并且進一步分析了喹諾酮相關(guān)耐藥基因的情況。另外，耐藥基因的檢測有助于了解烏魯木齊地區(qū)流行株的耐藥機制，從而豐富和完善牛羊肉源致病性沙門氏菌耐藥性的分子流行病學(xué)資料，也為臨床治療沙門氏菌疾病的合理用藥及沙門氏菌多重耐藥機制的進一步研究提供實驗依據(jù)。

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Quinolone Resistance Characteristics and Related Gene Analysis of Salmonella in Beef and Mutton Retailed in ürümqi

GE Kun1, WU Yun1,*, YANG Baowei2, WU Haotian1, WANG Wei1, ZHANG Yanan1, TIAN Ge1, MA Wenrui1
(1. College of Food Science and Pharmaceutical Science, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China; 2. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Objective: To determine the antibacterial susceptibility to 15 antibiotics and quinolone resistance genes of 30 Salmonella isolates from beef and mutton ürümqi, Xinjiang for the purpose of better understanding the development and transmission pathways of antibiotic resistance in Salmonella and hence providing basic information for preventing and controlling Salmonella-related diseases. Methods: The drug sensitivity of Salmonella isolates was evaluated by the agar dilution method. In addition, polymerase chain reaction and gene sequencing were used to detect the quinolone resistancedetermining regions mutations and the plasmid-mediated quinolone resistance genes. Results: The drug resistance rates of 30 Salmonella isolates to trimethoprim, chloramphenicol nalidixic acid, tetracycline, sulf i soxazole, streptomycin, trimethoprim/ sulfamethoxazole, amoxicillin/clavulanic, ampicillin were 100%, 86.7%, 66.7%, 60.0%, 50.0%, 33.3%, 26.7%, 6.7% and 6.7%, respectively. All the Salmonella isolates were sensitive to ciprof l oxacin, ceftriaxone, gentamicin, kanamycin, cefoxitin and amikacin. The number of Salmonella carrying gyrA mutations was 14, and the main type of mutation was Ser83Phe; the number of Salmonella having parC mutations was 25, and the main type of mutation was Thr57Ser. Conclusions: The Salmonella isolates from beef and mutton retailed in ürümqi are resistant to multiple antibiotics. Therefore, we should be seriously concerned about this phenomenon. The antibiotic resistance mutations and the plasmid-mediated quinolone resistance genes may be an important cause of the antimicrobial resistance of Salmonella isolates from beef and mutton in some extend.

Salmonella; antibacterial susceptibility; quinolone; antibiotic resistance gene

10.7506/spkx1002-6630-201704018

TS201.3

A

1002-6630（2017）04-0107-06

2016-05-26

新疆維吾爾自治區(qū)“十三五”重大專項（2016A01001-5）

葛琨（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：gekunwlmq@163.com

*通信作者：武運（1965—），女，教授，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wuyunster@sina.com

葛琨, 武運, 楊保偉, 等. 烏魯木齊牛羊肉源沙門氏菌對喹諾酮類藥物的耐藥狀況及相關(guān)基因分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 107-112. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704018. http://www.spkx.net.cn

GE Kun, WU Yun, YANG Baowei, et al. Quinolone resistance characteristics and related gene analysis of Salmonella in beef and mutton retailed in ürümqi[J]. Food Science, 2017, 38(4): 107-112. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201704018. http://www.spkx.net.cn