喬沙沙 周永娜 劉晉仙 景炬輝 賈 彤 李 毳 楊 欣 柴寶峰

(1. 山西大學(xué)黃土高原研究所 太原 030006； 2. 山西大學(xué)生物技術(shù)研究所 太原 030006； 3. 山西財(cái)經(jīng)大學(xué)環(huán)境經(jīng)濟(jì)學(xué)院 太原 030006)

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關(guān)帝山針葉林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征*

喬沙沙1周永娜1劉晉仙1景炬輝2賈 彤1李 毳3楊 欣1柴寶峰1

(1. 山西大學(xué)黃土高原研究所 太原 030006； 2. 山西大學(xué)生物技術(shù)研究所 太原 030006； 3. 山西財(cái)經(jīng)大學(xué)環(huán)境經(jīng)濟(jì)學(xué)院 太原 030006)

【目的】 分析環(huán)境與空間因素在寒溫性針葉林土壤細(xì)菌群落構(gòu)建中的作用，為區(qū)域森林生態(tài)系統(tǒng)管理措施的制定提供理論依據(jù)?！痉椒ā?利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析關(guān)帝山龐泉溝自然保護(hù)區(qū)華北落葉松林(Lp)、青杄林(Pw)以及油松林(Pt)4個(gè)土壤細(xì)菌群落(LpMC1、LpMC2、PwMC 和PtMC)的結(jié)構(gòu)，同時(shí)測(cè)定土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性，探討細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與森林類型和土壤環(huán)境因子的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】 1) 在該區(qū)域的森林土壤細(xì)菌群落中，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、疣微菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、衣原體門和硝化螺旋菌門為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群。 2) 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群相對(duì)豐度和土壤環(huán)境因子的RDA分析表明，土壤含水率、碳氮比、pH以及土壤酶活性是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因子。其中，變形菌門中的大部分類群和擬桿菌門更適于生活在酸性、濕度大、營(yíng)養(yǎng)狀況良好的土壤中，主要碳源是易分解性碳； 放線菌門、浮霉菌門和綠彎菌門則在堿性、干旱、營(yíng)養(yǎng)貧瘠的土壤中更占優(yōu)勢(shì)，主要分解頑固性碳。 3) Alpha多樣性分析結(jié)果表明，土壤細(xì)菌群落多樣性在4個(gè)樣地間存在差異，在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的油松林樣地土壤中細(xì)菌群落(PtMC)豐富度低，多樣性高； 而在營(yíng)養(yǎng)豐富的高海拔華北落葉松樣地中細(xì)菌群落(LpMC1)豐富度高，多樣性低。 4) 細(xì)菌群落Beta多樣性分析結(jié)果表明，青杄林和油松林的土壤細(xì)菌群落(PwMC與PtMC)、高海拔華北落葉松林和低海拔華北落葉松林的土壤細(xì)菌群落(LpMC1與LpMC2)結(jié)構(gòu)分別具有相似性?！窘Y(jié)論】 受環(huán)境選擇和擴(kuò)散限制的共同影響，不同針葉林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性具有顯著差異。據(jù)此，可通過制定不同的育林措施，改變林下土壤環(huán)境，進(jìn)而優(yōu)化土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)； 提高土壤碳匯，促進(jìn)土壤氮、硫、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)，提高土壤肥力。

環(huán)境選擇； 擴(kuò)散限制； 關(guān)帝山； 針葉林； 高通量測(cè)序； 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

隨著全球生物多樣性的逐漸喪失，生物群落多樣性形成和維持機(jī)制成為生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)。通過對(duì)動(dòng)植物的研究，生態(tài)學(xué)家提出了一些共有模式及其背后生態(tài)學(xué)過程的假說。大型生物群落構(gòu)建的基本過程包括擴(kuò)散、選擇、成種和漂變。由于微生物具有世代周期短、種群數(shù)量巨大以及橫向基因轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，微生物的生態(tài)過程和進(jìn)化過程更多發(fā)生在相同的時(shí)空尺度，所以微生物群落的構(gòu)建機(jī)制與大型生物相比可能存在一定的差異。同時(shí)由于微生物鑒定比較困難，比較難以培養(yǎng)等原因(Wardetal.， 1990)，對(duì)于微生物群落多樣性的研究非常有限。近年來，分子生物學(xué)、組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的應(yīng)用，推動(dòng)了微生物生態(tài)學(xué)前所未有的發(fā)展，人們開始利用微生物系統(tǒng)驗(yàn)證生態(tài)學(xué)中的一些基本理論，如中性理論、生態(tài)位理論等，豐富和發(fā)展生態(tài)學(xué)的理論體系。

關(guān)于微生物群落構(gòu)建機(jī)制的爭(zhēng)論始于1934年Bass-Becking提出的“Everything is everywhere, but environment selects”的觀點(diǎn)，其認(rèn)為微生物具有極強(qiáng)的擴(kuò)散能力，不存在擴(kuò)散限制，選擇對(duì)于微生物群落的構(gòu)建起主導(dǎo)性作用，不同的非生物環(huán)境因子決定了微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性。近年來的研究結(jié)果不斷挑戰(zhàn)這一觀點(diǎn)(Guoetal.， 2015； Lindstr?metal.， 2012)，認(rèn)為環(huán)境選擇(生物因子和非生物因子)和擴(kuò)散限制是生態(tài)系統(tǒng)中生物群落結(jié)構(gòu)形成的2個(gè)主要過程(Cottenie， 2005)，同樣適合于微生物群落。在溫帶森林中的研究顯示，環(huán)境生物因子對(duì)根際微生物群落的影響主要表現(xiàn)在諸如植物群落的組成(Royetal.， 2013)、生產(chǎn)力(Kranabetteretal.， 2009)、根系密度(Peayetal.， 2011)等方面。森林生態(tài)系統(tǒng)中真菌群落的分布與非生物因子，如土壤pH(Polmeetal.， 2013)、土壤營(yíng)養(yǎng)(Coxetal.， 2010)和海拔(Bahrametal.， 2012)等密切相關(guān)，支持微生物群落形成過程中環(huán)境選擇的作用。群落β多樣性隨地理距離的增加而降低(distance-decay relationship)是生物地理學(xué)的主要模型，適合于不同的動(dòng)植物類型、地理梯度和環(huán)境，甚至在生態(tài)位過程(環(huán)境差異)和中性過程(擴(kuò)散限制)中也存在這樣的模式。最近對(duì)微生物群落的研究顯示，群落的相似度也表現(xiàn)出隨地理距離增加而衰減的模式。土壤真菌群落呈現(xiàn)出高度的局域(local scale)的生物多樣性，如叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal fungi，AM)、子囊真菌(ascomyceteous fungi)(Bahrametal.， 2013)。對(duì)全球尺度(Polmeetal.， 2013)和區(qū)域尺度(regional scale)的4個(gè)熱帶森林和3個(gè)溫帶森林的外生菌根菌(ectomycorrhizalfungal)的研究表明，擴(kuò)散過程影響了真菌群落的構(gòu)建(Tedersooetal.， 2011)。但也有研究顯示，外生菌根菌群落不受擴(kuò)散限制的影響(Bahrametal.， 2012)。對(duì)于鹽沼濕地原核微生物細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，地理尺度從厘米級(jí)到大洲之間，群落的相似性在局域和區(qū)域尺度上都隨地理距離的增加而下降。對(duì)于寒溫帶針葉林土壤微生物群落的研究較少，其中細(xì)菌群落多樣性及其維持機(jī)制的研究未見報(bào)道。

山西省龐泉溝自然保護(hù)區(qū)位于呂梁山脈的關(guān)帝山腹地，是以保護(hù)世界珍禽褐馬雞(Crossoptilonmantchuricum)及其棲息地華北落葉松(Larixgmeliniivar.principis-rupprechtii)、白杄(Piceameyeri)、青杄(Piceawilsonii)天然次生林為主的森林和野生動(dòng)物類型的自然保護(hù)區(qū)。森林群落類型多樣、結(jié)構(gòu)差異明顯，可以在小尺度范圍忽略氣候因子的差異，研究森林植被類型和土壤因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，又可以利用不同的海拔研究氣候因子的影響，是研究微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的理想地。本文基于16S rRNA的高通量測(cè)序技術(shù)研究了該區(qū)常綠針葉林[青杄和油松(Pinustabulaeformis)]和落葉針葉林(華北落葉松)土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)，旨在揭示微生物群落結(jié)構(gòu)和功能受氣候、環(huán)境因子和植物群落的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

龐泉溝自然保護(hù)區(qū)位于山西省交城、文水、方山、婁煩等縣的交界處。地理位置111°22′—111°33′E，37°45′—37°55′N。南北長(zhǎng)15 km，東西長(zhǎng)14.5 km，總面積10 443.5 hm2，海拔1 600～2 831 m，主要森林類型是由針葉林華北落葉松、白杄、青杄、油松以及山楊(Populusdavidiana)、白樺(Betulaplatyphylla)、紅樺(Betulaalbosinensis)和遼東櫟(Quercusliaotungensis)等樹種組成的純林和混交林。氣候?yàn)榕瘻貛Т箨懶陨降貧夂?，年平均氣?.2 ℃，年平均降水量822.6 mm。成土母質(zhì)以花崗巖、片麻巖、石英巖和角閃巖為主。土壤屬于山地土壤類型，從低到高垂直帶譜為山地褐土、山地淋溶褐土、山地棕壤和亞高山草甸土。

試驗(yàn)地設(shè)在保護(hù)區(qū)的神尾溝和八道溝。4個(gè)微生物群落(LpMC1、LpMC2、PwMC、PtMC)樣品分別取自陰坡高海拔華北落葉松林(111°32′22.81″E，37°53′13.93″N； 2 709 m)、陰坡低海拔華北落葉松林(111°30′33.77″E，37°53′06.30″N； 1 950 m)、陰坡青杄林(111°27′9.12″E，37°51′56.22″N； 1 888 m)和陽坡油松林(111°27′39.16″E，37°50′54.30″N； 1 894 m)。

1.2 樣品采集

于2015年7月采樣。運(yùn)用5點(diǎn)混合取樣法采集土壤，即在每個(gè)采樣地點(diǎn)設(shè)置10 m×10 m的樣方，利用對(duì)角線法選取5個(gè)點(diǎn)。首先去除地表約5 cm厚的地表植被和覆蓋物，再用土鉆鉆取0～20 cm深的土壤樣品，放入無菌塑料袋內(nèi)，冰盒內(nèi)保存，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，并于-20 ℃下保存。在 24 h之內(nèi)，將每個(gè)樣地的5個(gè)土壤樣品混合均勻并過直徑為2 mm的網(wǎng)篩，除去根系、石塊等雜物，其中一部分風(fēng)干用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定，一部分放入-80 ℃冰箱保存，用于高通量測(cè)序。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤環(huán)境因子分析 1) 土壤理化性質(zhì)分析自然風(fēng)干的土樣用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定。土壤含水量用烘干法測(cè)定，將盛有新鮮土樣的鋁盒置于105 ℃的烘箱中過夜烘干至恒質(zhì)量； 用容量瓶法測(cè)定土壤密度，并計(jì)算土壤孔隙度； 土壤粒徑用馬爾文 mastersizer 2000測(cè)定； 土壤 pH(土水比為1∶2.5)用電位法測(cè)定，稱取10 g風(fēng)干土樣加入25 mL 無CO2蒸餾水，攪拌均勻，靜置30 min后測(cè)定； 土壤溫度(T10)用LI-6400的溫度探針測(cè)定； 土壤全氮(TN)、全碳(TC)、全硫(TS)用vario MACRO cube元素分析儀(德國(guó)) 測(cè)定。

2) 土壤酶活性分析 脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，其活性以37 ℃下培養(yǎng)24 h 后1 g土壤產(chǎn)生的NH3-N的毫克數(shù)表示； 蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法，其活性以37 ℃培養(yǎng)24 h 后1 g土壤產(chǎn)生的葡萄糖的 毫克數(shù)表示； H2O2酶采用KMnO4滴定法，其活性以20 min 內(nèi)1 g土壤分解的過氧化氫的毫克數(shù)表示(關(guān)松蔭， 1986)。

1.3.2 土壤細(xì)菌群落高通量測(cè)序分析 4個(gè)樣地的土壤樣品分別稱取0.5 g，各3次重復(fù)，用E.Z.N.A.Soil DNA Kit 試劑盒(Sangon公司，中國(guó))提取土壤微生物基因組總DNA，詳細(xì)步驟參考試劑盒說明書。將提取到的土壤微生物總DNA 溶解于 100 μL 無菌水后，通過微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000 UV-Vis) 測(cè)定DNA的濃度和純度(OD260/OD280和OD260/OD230)。此外，利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離5 μL 的DNA(0.5 ×TAE 緩沖液)，分析DNA 的完整性和相對(duì)濃度。最后將每個(gè)土樣提取出的3個(gè)DNA樣品充分混合后送往上海生物工程有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。通過Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)，利用引物341(CCCTACACGACG CTCTTCCGATCTG(barcode) CCTACGGGNGGCWG CAG)和805R(GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC)對(duì)16S rDNA高變區(qū)V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序。PCR 擴(kuò)增體系主要包括: 0.5 μL的PlantiumTaq (5 U·μL-1)，5.0 μL 的10×EasyTaq Buffer(Mg2 +Plus)，4.0 μL 的dNTPs，0.5 μL 的引物50 μmol·L-1，加入5.0 μL 的DNA 模板和無菌水至50 μL 反應(yīng)體系。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件:94 ℃，3.0 min; 5 × (94 ℃，30 s; 45 ℃， 20 s; 65 ℃，30 s); 20 × (94 ℃， 20 s; 55 ℃， 20 s; 72 ℃，30 s); 72 ℃，5 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各樣地變量之間的顯著性差異均采用單因素方差分析(one-way analysis)和多重比較分析(LSD)，土壤環(huán)境因子和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。所有分析采用SPSS 19.0 軟件和Excel 2013軟件進(jìn)行，顯著性水平設(shè)為P<0.05。利用Mothur軟件計(jì)算土壤細(xì)菌群落的Alpha多樣性值，包括Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和ACE指數(shù)等，用以評(píng)估樣品中的物種豐富度和物種多樣性。基于β多樣性計(jì)算中的Unifrac metric距離計(jì)算結(jié)果作距離熱圖，來衡量樣本間物種組成的相似度。使用Canoco 4.5軟件對(duì)土壤環(huán)境因子和細(xì)菌群落進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis, RDA)，為保證數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及減小異常值對(duì)分析結(jié)果的影響，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og (x+1)轉(zhuǎn)換，顯著性水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同森林類型的土壤環(huán)境因子

2.1.1 土壤理化性質(zhì) 本研究調(diào)查了3種針葉林4個(gè)樣地土壤理化性質(zhì)(表1)。土壤pH 在4個(gè)樣地間差異顯著，陽坡生長(zhǎng)的溫帶針葉林油松林土壤偏堿性，而陰坡生長(zhǎng)的寒溫性針葉林華北落葉松和青杄林樣地土壤均呈弱酸性。土壤碳氮含量及其比值在4個(gè)樣地間差異顯著，高海拔華北落葉松樣地的碳氮含量最大，而低海拔華北落葉松樣地中碳含量以及碳氮比最小，說明氣候條件(溫度、降水)對(duì)土壤碳氮含量具有一定的影響。油松林樣地中碳氮比最大、氮含量最小，說明溫性常綠針葉林和寒溫性落葉針葉林土壤碳氮代謝過程和效率存在差異性。4個(gè)樣地土壤含水率介于8.55%～47.93% 之間，高海拔落葉松林樣地中土壤含水率最高，陽坡油松林樣地中最低，低海拔落葉松林和云杉林樣地之間無顯著性差異。高海拔落葉松林樣地的土壤粒徑顯著大于其他3個(gè)樣地，而土壤溫度小于其他3個(gè)樣地，較低海拔的落葉松林、云杉林和油松林樣地之間無顯著差異。云杉林樣地中土壤孔隙度最大，其他3個(gè)樣地之間無顯著性差異。高海拔落葉松林樣地土壤的總硫含量最多，而低海拔落葉松林和油松林樣地中較少，且無顯著差異。

2.1.2 土壤酶活性 土壤酶主要來源于動(dòng)植物和微生物細(xì)胞的分泌及其殘?bào)w的腐解(關(guān)松蔭， 1986)。植物種類和組成不同，根系分秘物和枯落物的質(zhì)和量就不同，導(dǎo)致土壤酶活性的差異。本研究中4個(gè)樣地土壤酶活性差異顯著(表1)。油松林土壤過氧化氫酶和脲酶活性顯著大于其他3個(gè)樣地，低海拔華北落葉松林土壤中這2種酶的活性均為最?。?高海拔和低海拔落葉松林樣地之間2種酶的活性無顯著差異。蔗糖酶活性在4個(gè)樣地間差異顯著，高海拔華北落葉松林的土壤蔗糖酶活性最高(6.07±0.373)mg·g-1(24 h)-1，油松林樣地土壤蔗糖酶活性最低(0.58±0.041)mg·g-1(24 h)-1。

表1 土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性①Tab. 1 Soil physicochemical characteristics and soil enzyme activity of sampling sites

①表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同一行數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)。下同。Data in the table are mean ± standard deviation．Different lowercase letters within rows indicate significant difference atP<0.05 level．The same below．

2.1.3 土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系 土壤酶在土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)過程中扮演著重要角色(周禮愷， 1987)，可以作為土壤質(zhì)量的生物活性指標(biāo)。對(duì)土壤酶活性和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析(表2)，結(jié)果顯示，針葉林土壤過氧化氫酶和脲酶活性與土壤pH呈顯著或極顯著正相關(guān)，蔗糖酶活性與土壤含水率、碳氮硫含量均呈極顯著正相關(guān)，與pH呈顯著負(fù)相關(guān)。

表2 土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)間Pearson相關(guān)性分析①Tab. 2 Correlation coefficients between soil enzyme activities and physicochemical factors

①*：P<0.05； **：P<0.01.

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

利用Illumina高通量測(cè)序方法分析土壤細(xì)菌群落的多樣性和結(jié)構(gòu)，測(cè)序結(jié)果經(jīng)優(yōu)化后得到各樣地土壤16S 序列數(shù)共58 904條，總堿基數(shù)24 504 064 bp，平均長(zhǎng)度416 bp。樣品稀釋曲線如圖1，曲線雖未達(dá)到平緩，但文庫(kù)的覆蓋率已超過0.70(表3)，因此本次測(cè)序深度可以反映土壤細(xì)菌群落的真實(shí)情況。

2.2.1 土壤細(xì)菌群落α多樣性 物種多樣性與生態(tài)系統(tǒng)的功能密切相關(guān)。本研究中4種土壤細(xì)菌群落的多樣性如表3所示。依據(jù)細(xì)菌OTU數(shù)量計(jì)算出的α多樣性指數(shù)中，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在LpMC1中最大，PtMC中最??； Shannon指數(shù)在PtMC中最大，LpMC1中最??； 而Simpson指數(shù)則在LpMC1中最大，PtMC中最小。因此，樣地LpMC1中群落豐富度最大，多樣性最小，而PtMC中群落多樣性最大，豐富度最小。2個(gè)樣地間土壤因子的差異可能是導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因，如PtMC所在的油松林土壤pH(8.13±0.038)、過氧化氫酶活性(1.05±0.223)mg·g-1(20 min)-1和脲酶活性(4.45±0.148)mg·g-1(24 h)-1最大，含水率(8.55±0.99)%、氮含量(0.124±0.002)%和蔗糖酶活性(0.58±0.041)mg·g-1(24 h)-1最小，而LpMC1所在的高海拔落葉松樣地正好相反，因此，土壤pH、含水率、氮含量以及土壤酶活性是影響細(xì)菌群落豐富度和多樣性的主要環(huán)境因素。

圖1 4個(gè)細(xì)菌群落高通量測(cè)序16S rDNA稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of 16S rDNA for high throughput sequencing of four bacteria communities

表3 細(xì)菌群落多樣性Tab.3 Diversity of bacteria communities

2.2.2 土壤細(xì)菌群落β多樣性 基于樣本間unifrac距離矩陣?yán)L制的距離熱圖(圖2)可以看出，PwMC和PtMC以及 LpMC1和LpMC2分別聚為一類，說明PwMC和PtMC之間以及LpMC1和LpMC2之間細(xì)菌群落組成具有相似性。4個(gè)樣地土壤細(xì)菌群落(LpMC1、LpMC2、PwMC、PtMC)中共有31個(gè)細(xì)菌門，豐度大于1%的細(xì)菌門共有11個(gè)(圖3A)，其中變形菌門(Proteobacteria)(44.93%，44.19%，48.40%，41.77%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(20.05%，15.18%，7.87%，6.21%)、放線菌門(Actinobacteria)(4.89%，8.31%，8.15%，11.53%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(7.56%，5.92%，8.56%，8.01%)、浮霉菌門(Planctomycetes)(4.92%，5.20%，6.72%，13.21%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(4.14%，5.60%，8.31%，5.63%)豐度較大，這些門的細(xì)菌主要執(zhí)行有機(jī)質(zhì)分解功能(Lietal.， 2016； Stursovaetal.， 2012)。厚壁菌門(Firmicutes)(5.68%，4.65%，2.41%，3.93%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(2.07%，3.28%，2.90%，3.57%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(2.60%，1.98%，2.09%，3.16%)、衣原體門(Chlamydiae)(0.68%，1.44%，2.42%，0.78%)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(0.53%，1.19%，0.57%，0.20%)豐度較小，這些門的細(xì)菌主要作用是固氮和固碳(Debruynetal.， 2011； Huangetal.， 2011； Zhangetal.， 2016)。

圖3 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(A)和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目相對(duì)豐度(B)Fig.3 Relative abundance of dominant bacteria phyla(A)and dominant bacteria order(B)

圖2 目水平樣本距離熱圖Fig.2 Heatmap of distance at order level

LpMC1、LpMC2、PwMC、PtMC群落中豐度大于5%的細(xì)菌目共有8個(gè)(圖3B)，分別是γ-變形菌綱(γ-proteobacteria)中的腸桿菌目(Enterobacteriales)(12.57%，3.66%，2.46%，2.90%)、α-變形菌綱(α-proteobacteria)中的鞘脂單胞菌目(Sphingobacteriales)(5.67%，8.45%，5.44%，3.60%)和根瘤菌目(Rhizobiales)(5.08%，6.98%，12.50%，8.91%)、β-變形菌綱(β-proteobacteria)中的伯克氏菌目(Burkholderiales)(4.13%，5.13%，5.07%，4.20%)、擬桿菌門的擬桿菌目(Bacteroidales)(11.93%，1.37%，0.72%，0.54%)和鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)(5.67%，8.45%，5.44%，3.60%)、浮霉菌門的浮霉菌目(Planctomycetales)(3.50%，3.29%，5.10%，10.71%)以及Chthoniobacterales(5.21%，3.83%，6.33%，5.28%)。其中，腸桿菌目(12.57%)和擬桿菌目(11.93%)在樣地LpMC1中占優(yōu)勢(shì)，鞘脂桿菌目(8.45%)、根瘤菌目(12.50%)和浮霉菌目(10.71%)分別是樣地LpMC2、PwMC和PtMC中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目。

樣地PwMC和PtMC海拔接近，分別為1 888 m和1 894 m，地理距離相對(duì)較近(2.11 km)。LpMC1和LpMC2樣地海拔較高，與 PwMC和PtMC樣地的地理距離較遠(yuǎn)，而且之間有山梁間隔。研究區(qū)細(xì)菌群落β多樣性與地理距離的關(guān)系如圖4所示，二者之間具有一定的相關(guān)性(R2=0.853)，說明一定程度上地理距離和阻隔影響森林土壤細(xì)菌群落的β多樣性，擴(kuò)散限制可能是研究區(qū)細(xì)菌群落多樣性的一個(gè)影響因素。

圖4 細(xì)菌群落β多樣性與地理距離相關(guān)性Fig.4 Relationship between bacterial community β diversity and geographic distance

圖5 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(A)和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目(B)與土壤環(huán)境因子冗余分析Fig.5 Redundancy analysis(RDA)on soil dominant bacteria phyla(A)and soil dominant bacteria order(B)constrained by soil variables

2.2.3 細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)類群與環(huán)境因子的相關(guān)性 對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目相對(duì)豐度和土壤環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析(圖5)，結(jié)果顯示第1軸和第2軸累計(jì)解釋變異量分別達(dá)到91.6%和96.8%，說明土壤環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有很大的影響。在門水平上(圖5A)，土壤過氧化氫酶活性(r=-0.924 8)、含水率(r=0.889 5)、蔗糖酶活性(r=0.822 1)、脲酶活性(r=-0.811 8)、碳氮比(r=- 0.697 8)以及pH(r=- 0.658 9)與軸1的相關(guān)性較大，第1軸解釋率達(dá)到了64.2%。在目水平上(圖5B)，土壤含水率(r=0.957 4)、蔗糖酶活性(r=- 0.697 8)、過氧化氫酶活性(r=- 0.697 8)和脲酶活性(r=- 0.697 8)與軸1相關(guān)性較大，pH(r=- 0.697 8)和碳?xì)浔?r=- 0.697 8)與軸2相關(guān)性較大，第1軸解釋率達(dá)到了82.5%。由此可見，土壤含水率、碳氮比、pH、過氧化氫酶活性、脲酶活性以及蔗糖酶活性對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著。

對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群和土壤環(huán)境因子進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如表4所示。在門水平上，變形菌門和擬桿菌門豐度與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，放線菌門、疣微菌門、浮霉菌門以及綠彎菌門則呈顯著或極顯著正相關(guān)； 擬桿菌門和厚壁菌門與土壤含水率呈顯著或極顯著正相關(guān)，放線菌門和浮霉菌門呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)； 放線菌門、浮霉菌門和綠彎菌門與土壤碳氮比呈顯著或極顯著正相關(guān)，變形菌門和擬桿菌門呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)； 擬桿菌門與過氧化氫酶活性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，疣微菌門和浮霉菌門與過氧化氫酶活性呈顯著正相關(guān)； 擬桿菌門與脲酶活性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，放線菌門、疣微菌門、浮霉菌門和綠彎菌門呈顯著或極顯著正相關(guān)； 放線菌門和浮霉菌門與蔗糖酶活性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，擬桿菌門和厚壁菌門呈顯著或極顯著正相關(guān)。

在目水平上，浮霉菌目與土壤pH呈顯著或極顯著正相關(guān)； 腸桿菌目和擬桿菌目與土壤含水率呈顯著或極顯著正相關(guān)，根瘤菌目和浮霉菌目顯著或極顯著負(fù)相關(guān)； 浮霉菌目與土壤碳氮比呈顯著或極顯著正相關(guān)，鞘脂桿菌目、伯克氏菌目和鞘脂單胞菌目呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)； 鞘脂桿菌目與過氧化氫酶活性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，浮霉菌目呈顯著正相關(guān)； 鞘脂桿菌目和鞘脂單胞菌目與脲酶活性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，浮霉菌目呈顯著或極顯著正相關(guān)； 根瘤菌目和浮霉菌目與蔗糖酶活性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，腸桿菌目和擬桿菌目呈顯著或極顯著正相關(guān)。

表4 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群與土壤環(huán)境因子相關(guān)性分析①Tab. 4 Correlation coefficients between dominant bacteria groups and available edaphic factors

①*：P<0.05； **：P<0.01.

3 討論

土壤微生物參與土壤碳、氮等元素的循環(huán)及養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化過程，調(diào)控土壤碳截獲能力、碳礦化過程以及生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力(Hanetal.， 2007)。北方森林生態(tài)系統(tǒng)中儲(chǔ)存有大量的凋落物，土壤營(yíng)養(yǎng)豐富，因此相比于固碳、固氮微生物，土壤中分解有機(jī)質(zhì)的微生物更占優(yōu)勢(shì)，本研究中變形菌門(41.77%～48.40%)、擬桿菌門(6.21%～20.05%)、放線菌門(4.89%～11.53%)在寒溫性針葉林土壤細(xì)菌群落中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。土壤含水率、pH以及碳氮比是本區(qū)寒溫性針葉林細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子，這一觀點(diǎn)與前人的研究(Lauberetal.， 2009； Logueetal.， 2011)基本一致。細(xì)菌群落對(duì)土壤含水率的變化敏感，Schimel等(1999)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間干燥能夠?qū)е峦寥牢⑸锖粑蜕锪拷档停⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)發(fā)生變化，尤其是潮濕和干燥的時(shí)間長(zhǎng)度對(duì)土壤微生物影響較大。pH 在土壤生物地球化學(xué)循環(huán)過程中具有重要作用，與植被類型、土壤類型、管理措施等有關(guān)(Lauberetal.， 2008)，對(duì)土壤中的物理顆粒之間的相互吸附、水溶液解吸、土壤顆粒溶解沉淀、化學(xué)配合反應(yīng)都具有調(diào)節(jié)作用，是細(xì)菌在大尺度范圍內(nèi)分布的首要影響因子(Chuetal.， 2010； Shenetal.， 2013； Yuanetal.， 2014)。本研究小尺度范圍的生境中，pH 可以通過改變土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而影響細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)。土壤碳氮比通常被認(rèn)為是土壤質(zhì)量的敏感指標(biāo)，可衡量土壤C、N 營(yíng)養(yǎng)平衡狀況，低的碳氮比可以加快微生物的分解和氮的礦化速率(H?gbergetal.， 2006)。根據(jù)對(duì)碳礦化潛力和生長(zhǎng)速率的不同，一些學(xué)者將土壤細(xì)菌分為富營(yíng)養(yǎng)型和貧營(yíng)養(yǎng)型2種(Fiereretal.， 2007)。富營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌生活在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中，主要分解土壤表層不穩(wěn)定C庫(kù)，包括擬桿菌門和α、γ變形菌綱；相反，貧營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌主要分解土壤深層難降解C庫(kù)，包括放線菌門、酸桿菌和 δ 變形菌(Bastianetal.， 2009； Fiereretal.， 2007)。本研究表明，擬桿菌門和變形菌門與土壤碳氮比呈顯著負(fù)相關(guān)，而放線菌門、浮霉菌門和綠彎菌門呈正相關(guān)，且本研究中營(yíng)養(yǎng)狀況良好的樣地的細(xì)菌群落，如LpMC1中腸桿菌目(γ-變形菌綱)和擬桿菌目(擬桿菌門)占優(yōu)勢(shì)，鞘脂桿菌目(擬桿菌門)和根瘤菌目(α-變形菌綱)分別是LpMC2和PwMC中的優(yōu)勢(shì)類群，而營(yíng)養(yǎng)貧瘠的樣地的細(xì)菌群落，如PtMC中浮霉菌目為優(yōu)勢(shì)類群，進(jìn)一步印證了上述學(xué)者的觀點(diǎn)。Zeng等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，在酸性表層土壤中，β-變形菌和擬桿菌門占優(yōu)勢(shì)，主要分解纖維素(Stursovaetal., 2012)，而放線菌門豐度與土壤 pH和碳氮比呈正相關(guān)，與水分呈負(fù)相關(guān)，與本研究結(jié)果一致(表4)，說明在森林生態(tài)系統(tǒng)中，變形菌門中的大部分類群和擬桿菌門更適于生活在酸性、濕度大、營(yíng)養(yǎng)狀況良好的土壤中，主要碳源是易分解性碳； 放線菌門、浮霉菌門和綠彎菌門則在堿性、干旱、營(yíng)養(yǎng)貧瘠的土壤中更占優(yōu)勢(shì)，主要分解頑固性碳。由表1和表4可知，LpMC1樣地的土壤環(huán)境更適于變形菌門和擬桿菌門的生存，因此細(xì)菌的均勻度最小，多樣性最小，而PtMC樣地的土壤環(huán)境適于多數(shù)細(xì)菌的生存，因此細(xì)菌的多樣性最大。本研究結(jié)果說明，環(huán)境選擇對(duì)土壤細(xì)菌群落組成具有顯著作用。

β多樣性分析結(jié)果表明，PwMC和PtMC之間以及LpMC1和LpMC2之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分別具有更高的相似性(圖2)，說明土壤細(xì)菌群落除受土壤環(huán)境因子影響外，還受其他環(huán)境因子如植被類型和地理距離的影響。陸地生態(tài)系統(tǒng)中的土壤微生物絕大多數(shù)為異養(yǎng)微生物，主要以植物分泌物或植物殘?bào)w為食，因此，植被對(duì)土壤微生物的組成和功能有很大影響(Hooperetal.， 2000)。目前關(guān)于植被類型對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響機(jī)制沒有統(tǒng)一結(jié)論。有研究認(rèn)為，植被可能通過凋落物影響土壤微生物群落組成，因?yàn)闃浞N對(duì)森林凋落物的性質(zhì)和分解狀況有較大的影響，云杉林和油松林凋落物質(zhì)地較硬，木質(zhì)類物質(zhì)含量較高(常雅軍等， 2009)，而木質(zhì)類物質(zhì)會(huì)抑制微生物的分解作用(Tayloretal.， 1989)，因此不同的樹種會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生不同的影響。另外，植被類型可以通過植物根系分泌物對(duì)細(xì)菌群落產(chǎn)生影響。根系分泌物可為土壤微生物提供碳源和能源，植物通過向土壤中輸入氨基酸、有機(jī)酸、糖類、酚類和次生代謝產(chǎn)物等低分子量化合物以及黏液和蛋白質(zhì)等高分子質(zhì)量化合物(劉欣宇等， 2015)對(duì)微生物數(shù)量、種類、代謝及生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生積極或消極的影響(Martinez-Toledoetal.， 1988)，其中酚酸類物質(zhì)對(duì)土壤微生物生長(zhǎng)起抑制作用(朱麗霞等， 2003)。土壤酶是植物根際分泌物中的一類重要物質(zhì)，過氧化氫酶主要由植物根系分泌，脲酶和蔗糖酶主要由植物根系和土壤微生物共同分泌(關(guān)松蔭， 1986)。土壤酶可以通過改變土壤的理化性質(zhì)間接對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。本研究表明，過氧化氫酶活性與放線菌門、綠彎菌門及浮霉菌目等細(xì)菌豐度呈正相關(guān)，與鞘脂桿菌目和鞘脂單胞菌目等細(xì)菌呈正相關(guān)，蔗糖酶活性呈相反趨勢(shì)。這可能是由于土壤酶的釋放改變了土壤pH、碳氮含量等土壤理化性質(zhì)，如過氧化氫酶和脲酶的釋放提高了土壤的pH，更有利于放線菌門、浮霉菌門和綠彎菌門的生存； 蔗糖酶的釋放降低了土壤pH，增加了土壤營(yíng)養(yǎng)元素的含量，更有利于變形菌門和擬桿菌門的生存。因此，植被類型通過凋落物和根系分泌物對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。

最近對(duì)微生物群落的相關(guān)研究證實(shí)，群落相似度表現(xiàn)出隨地理距離的增加而衰減的模式(徐冰等， 2014)。盡管有些物種全球分布，但局域水平上的β多樣性是擴(kuò)散限制導(dǎo)致的(Martinyetal.， 2011)。對(duì)本研究中的細(xì)菌群落β多樣性和樣地之間的地理距離進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間呈顯著正相關(guān)(R2=0.853)(圖4)，說明細(xì)菌群落之間的差異在一定程度上受擴(kuò)散限制的影響。

4 結(jié)論

1) 關(guān)帝山龐泉溝自然保護(hù)區(qū)針葉林土壤細(xì)菌群落中，具有分解功能的變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、疣微菌門、浮霉菌門和酸桿菌門占優(yōu)勢(shì)； 其中，變形菌門中的大部分類群和擬桿菌門在酸性、濕度大、營(yíng)養(yǎng)狀況良好的土壤中更占優(yōu)勢(shì)，主要碳源是易分解碳； 放線菌門、浮霉菌門和綠彎菌門在堿性、干旱、營(yíng)養(yǎng)貧瘠的土壤中更占優(yōu)勢(shì)，主要分解頑固性碳。通過人為管理措施，降低這些細(xì)菌的豐度有利于提高森林土壤的碳匯。

2) 土壤細(xì)菌群落多樣性在4個(gè)樣地間均有差異，在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的油松林土壤中PtMC豐富度低，多樣性高； 在營(yíng)養(yǎng)豐富的高海拔華北落葉松林LpMC1中豐富度高，多樣性低。

3) 青杄林樣地PwMC和油松林樣地PtMC以及高海拔華北落葉松樣地LpMC1和低海拔華北落葉松樣地LpMC2中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分別具有相似性，說明環(huán)境選擇(含水率、碳氮比、pH、土壤酶活性、森林類型)和擴(kuò)散限制對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均有顯著影響，而環(huán)境選擇作用更為明顯。

本研究結(jié)果不僅有助于了解局域細(xì)菌群落的構(gòu)建機(jī)制，也為預(yù)測(cè)微生物群落對(duì)環(huán)境條件變化的響應(yīng)、適應(yīng)和反饋提供理論依據(jù)。據(jù)此，通過制定不同的育林措施，可改變林下土壤環(huán)境因子，進(jìn)而優(yōu)化土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高土壤碳匯，促進(jìn)土壤氮、硫、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)，提高土壤肥力。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

Characteristics of Soil Bacterial Community Structure in Coniferous Forests of Guandi Mountains，Shanxi Province

Qiao Shasha1Zhou Yongna1Liu Jinxian1Jing Juhui2Jia Tong1Li Cui3Yang Xin1Chai Baofeng1

(1.InstituteofLoessPlateauShanxiUniversityTaiyuan030006; 2.InstituteofBiotechnology,ShanxiUniversityTaiyuan030006; 3.CollegeofEnvironmentandEconomics,ShanxiUniversityofFinanceandEconomicsTaiyuan030006)

【Objective】 Soil microorganisms drive the biogeochemical processes of carbon, nitrogen, phosphorus and sulfur in soil, and play a key role in maintaining soil carbon sink and forest ecosystem function. In this study, we analysed effects of environmental and spatial factors on the soil bacterial community structure in cold-temperature coniferous forest,which would provide the oretical basis for making management measures for the local forest ecosystem.【Method】 This research analyzed four soil bacteria communities (LpMC1, LpMC2, PwMC and PtMC) in three coniferous forest types, includingLarixgmeliniivar.principis-rupprechtiiforest,Piceawilsoniiforest andPinustabulaeformisforest in the Pangquangou Nature Reserve in Guandi Mountains with Illumina high-throughput sequencing technology. Meanwhile, soil enzyme activity and soil physicochemical properties were determined to analyze the relationship between bacteria community structure and forest types as well as soil environmental factors. 【Result】1) In the region, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes, Acidobacteria, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Chloroflexi, Chlamydiae and Nitrospirae were dominant bacteria groups; 2) Redundancy analysis between the relative abundance of dominant bacterial groups and soil environmental parameters showed that soil moisture content, carbon and nitrogen ratio, pH and soil enzyme activity were the main factors that affected soil bacterial community structure; Proteobacteria and Bacteroidetes were relatively more suitable for living in the acid, humidity and nutrition rich status soil, and active carbon was the main carbon source, while Actinobacteria, Planctomycetes and Chloroflexi were more dominant in alkaline, drought and poor nutrient soil, and resistant carbon was the main carbon source.3) Alphadiversity analysis showed that there existed difference in diversity of soil bacteria community between the four coniferous forests.Low richness and high diversity were observed inP.tabulaeformisforest (PtMC) with poor nutrient while high richness and low diversity were observed inL.gmeliniivar.principis-rupprechtiiforest (LpMC1) on high altitude with rich nutrient.4) Beta diversity analysis showed that bacteria community structures ofP.wilsoniiforest andP.tabuliformisforest were the most similar whileL.gmeliniivar.principis-rupprechtiiforests on different elevations had the same trend.【Conclusion】 Environmental selection and dispersal limitation led to the significant differences of structure and biodiversity among soil bacterial communities from coniferous forests in the study area. Hereby, through the development of different forest management measures, we can change the soil environment,and then optimize the soil bacterial community structure, improve the soil carbon sequestration, and promote the recycling of nutrients such as nitrogen, sulfur and phosphorus in improving soil fertility.

environmentalselection; dispersal limitation; Guandi Mountains; coniferous forest; high-throughput sequencing; bacterial community structure

10.11707/j.1001-7488.20170211

2016-09-17；

2016-10-26。

山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上基金項(xiàng)目(201601D102054)； 國(guó)家自然科學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31600308)； 山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2012-059)。

*柴寶峰為通訊作者。本研究得到山西大學(xué)第十三期本科生科研訓(xùn)練項(xiàng)目的支持，王奕文、張旭和李夢(mèng)希同學(xué)參與研究，在此一并致謝。

S718.83

A

1001-7488(2017)02-0089-11