吳凱朝，鄧智年，魏源文，徐林，曹輝慶，蔣勝理，黃誠(chéng)梅*

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530007；2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，南寧530007）

割手密GX83-10愈傷組織誘導(dǎo)與成苗技術(shù)

吳凱朝1，鄧智年1，魏源文2，徐林1，曹輝慶2，蔣勝理2，黃誠(chéng)梅2*

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530007；2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，南寧530007）

以割手密GX83-10嫩葉鞘為材料，從愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、分化，分化苗增殖壯苗、生根等方面，探討了割手密嫩葉鞘愈傷組織誘導(dǎo)與成苗技術(shù)，為開(kāi)展割手密抗逆基因的功能鑒定研究提供技術(shù)參考。

割手密；愈傷組織誘導(dǎo)；成苗

割手密（Saccharum spontaneum L.）別名甜根子草、細(xì)莖野生種，禾本科甘蔗屬多年生草本植物，具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣、分蘗多等優(yōu)良特性，是最具有育種價(jià)值的甘蔗野生種質(zhì)資源，已被廣泛應(yīng)用于甘蔗雜交育種。當(dāng)前所有種植的甘蔗栽培品種幾乎都含有割手密的血緣，這些栽培品種中約10%的染色體來(lái)自割手密。近年來(lái)甘蔗育種家從形態(tài)標(biāo)記學(xué)、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、蛋白質(zhì)標(biāo)記、多種DNA分子標(biāo)記（SSR、AFLP、ISSR、RAPD、SCoT）對(duì)甘蔗和割手密種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析和分類，進(jìn)而揭示了我國(guó)當(dāng)前甘蔗栽培品種遺傳背景狹窄[1-6]，同時(shí)表明割手密在未來(lái)的甘蔗雜交育種中的應(yīng)用價(jià)值更顯突出和重要。目前，有關(guān)割手密的組培技術(shù)研究仍較少[7]，其研究主要是利用組培誘變篩選變異割手密植株，以期獲得更豐富的割手密種質(zhì)應(yīng)用于甘蔗育種，但針對(duì)割手密的組織培養(yǎng)技術(shù)研究、割手密中抗逆性相關(guān)基因分離、功能鑒定及遺傳轉(zhuǎn)化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。隨著分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得新品種是甘蔗遺傳改良新手段，特別是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)把割手密中抗逆優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到甘蔗栽培種是當(dāng)前研究的新方向，因此，通過(guò)超量表達(dá)與RNAi表達(dá)技術(shù)開(kāi)展割手密抗逆優(yōu)良基因鑒定尤為重要。這就要求割手密的愈傷組織誘導(dǎo)與成苗技術(shù)進(jìn)一步提高和完善，為割手密抗逆優(yōu)良基因的功能鑒定研究提供必要的前提基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

廣西甘蔗野生種質(zhì)資源圃保育的割手密GX83-10。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法以本課題組甘蔗組培技術(shù)為參考[8-9]，建立割手密愈傷組織誘導(dǎo)與成苗技術(shù)。

1.2.1 外植體準(zhǔn)備采集割手密GX83-10梢頭幼嫩部分，用70%酒精按常規(guī)表面消毒殺菌后，剝除外部葉鞘，留下直徑0.3 cm左右的心葉，橫切成大約0.5 cm×0.3 cm的小切片，用作外植體。

1.2.2 培養(yǎng)方法與培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)：將外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶5～6個(gè)外植體。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2，4-D 3.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7.0 g/L，pH 6.0。

愈傷組織繼代培養(yǎng)：接種外植體18 d后將愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷組織繼代培養(yǎng)基中，每瓶3～4塊愈傷組織。愈傷組織繼代培養(yǎng)基：MS+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7.0 g/L，pH6.0。

愈傷組織分化培養(yǎng)：愈傷組織繼代培養(yǎng)15～20 d后，將生長(zhǎng)良好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷組織分化培養(yǎng)基。愈傷組織分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7.0 g/L，pH 6.0。

分化苗增殖壯苗培養(yǎng)：將分化培養(yǎng)出來(lái)的割手密分化苗分切成每叢2~3株，轉(zhuǎn)接到增殖壯苗培養(yǎng)基中，增殖代數(shù)3～4代。增殖壯苗培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0 g/L，pH 6.0。

分化苗生根培養(yǎng)：將增殖壯苗培養(yǎng)獲得的割手密小苗分成5~6株/叢，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基：1/2 MS+NAA 4.0 mg/L+蔗糖30 g/L，pH 6.0。

1.2.3 培養(yǎng)方式上述外植體準(zhǔn)備和接種、轉(zhuǎn)接實(shí)驗(yàn)必須在超凈工作臺(tái)完成。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：暗培養(yǎng)15～20 d，溫度28±2℃；愈傷組織分化培養(yǎng)、分化苗增殖壯苗培養(yǎng)、分化苗生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為：光照培養(yǎng)20～25 d，光照14 h，光照度為1500～2000 lx，溫度28±2℃。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 割手密GX83-10愈傷組織誘導(dǎo)與繼代

用本課題組的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，共接種割手密GX83-10嫩葉鞘外植體258個(gè)，經(jīng)過(guò)9d暗誘導(dǎo)培養(yǎng)之后，共獲得128塊黃色的愈傷組織（圖1），誘導(dǎo)率為49.6%，愈傷褐化數(shù)56個(gè)，愈傷發(fā)生褐化率為43.8%。挑選出較好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷組織繼代培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以誘導(dǎo)出淡黃色顆粒胚性愈傷組織。

2.2 割手密GX83-10愈傷組織分化

挑選經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)后愈傷組織177塊在分化培養(yǎng)基上進(jìn)行光照培養(yǎng)，分化培養(yǎng)7d后，有65塊愈傷分化塊，其表面分化出綠色點(diǎn)苗狀組織，15～20d后開(kāi)始成苗（圖2），分化率為36.7%。從圖2也可以看出，割手密愈傷組織分化成苗受到褐化的影響較大，降低了分化率。

圖1 割手密愈傷組織誘導(dǎo)

圖2 割手密愈傷組織分化

2.3 割手密GX83-10分化苗增殖壯苗

待抗性苗長(zhǎng)至2 cm時(shí)，將叢芽剝離成單苗或2～3苗/叢進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。從表1可以得出，從纖細(xì)、矮小的割手密分化苗到獲得較壯的割手密化分苗(圖3、圖4、圖5），需經(jīng)過(guò)3代增殖壯苗培養(yǎng)，每代培養(yǎng)時(shí)間20 d左右。經(jīng)過(guò)3代增殖壯苗培養(yǎng)，總增殖系為21.04。

表1 割手密GX83-10分化苗增殖壯苗

圖3 分化苗增殖第一代

圖4 分化苗增殖第二代

圖5 分化苗增殖第三代

圖6 割手密分化苗生根

2.4 割手密GX83-10分化苗生根

增殖壯苗培養(yǎng)后的割手密分化苗接種到生根培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)10d的培養(yǎng)，分化苗長(zhǎng)出根點(diǎn)，根系逐漸發(fā)育完整、粗壯，植株長(zhǎng)勢(shì)良好，發(fā)根率可達(dá)到100%(表4）。苗生根量多，主根粗長(zhǎng)發(fā)達(dá)，側(cè)根多，表明獲得的割手密組培苗較為理想(圖6）。

3 小結(jié)與討論

本研究中，采用嫩葉為外植體的割手密愈傷組織誘導(dǎo)與成苗技術(shù)能較好地實(shí)現(xiàn)高效的繁殖率，獲得壯實(shí)的割手密組培苗，為進(jìn)一步開(kāi)展割手密抗逆優(yōu)良基因的功能鑒定研究提供技術(shù)支撐。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)外植體褐化是影響割手密GX83-10愈傷組織分化成苗的主要原因之一。為了防止褐化，提高分化成苗率，在接種前，將外植體置于含有50 mg/L檸檬酸的無(wú)菌水浸泡8～10 min，可以減輕外植體褐化。在愈傷誘導(dǎo)、繼代、分化，分化苗增殖、生根等培養(yǎng)基中，均加入適量濃度（30～60 mg/L）的檸檬酸，可以有效地減輕褐化程度。同時(shí)，根據(jù)褐化情況，及時(shí)將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基中，也可以減少褐化。

[1]曾華宗，鄭成木，朱穩(wěn)，高和瓊.甘蔗種質(zhì)間親緣關(guān)系及特異標(biāo)記的RAPD分析[J]．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2003，4（2）：99-103.

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[5]陸鑫，毛鈞，劉洪博，等．甘蔗野生種滇蔗茅種質(zhì)創(chuàng)新利用研究Ⅰ.甘蔗與滇蔗茅遠(yuǎn)緣雜交F1群體構(gòu)建與SSR分子標(biāo)記鑒定[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2012，13（2）：163-166.

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Embryogenic Callus Induction and Plantlets Growing Technology of Saccharum spontaneum L.

WU Kai-cao1,DENG Zhi-nian1,WEI Yuan-wen2,XU Lin1,CAO Hui-qing2, JIANG Sheng-li2,HUANG Cheng-mei2*
(1.Sugarcane Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement(Guangxi),China Ministry of Agriculture/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Nanning 530007; 2.Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab,Nanning 530007)

In the experiment,tender leaf sheath of Saccharum spontaneum L.(GX83-10)was cultured in vivo to study embryogenic callus induction,subculture and differentiation,the regenerated plantlets growing and rooting. The technology of embryogenic callus induction and plantlets growing of Saccharum spontaneum L.was established and optimized,which provide reference for its identification of stress resistance gene function.

Saccharum spontaneum L.;embryogenic callus induction;plantlets growing

S566.103

A

1007－2624（2017）02－0009－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.02.003

2016-12-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31400281）；廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014GXNSFAA118128）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本業(yè)務(wù)專項(xiàng)（2015JZ11、2015YT96）。

吳凱朝（1979-），副研究員，主要從事甘蔗分子遺傳育種研究工作，E-mail：kaichaowu@126.com。

黃誠(chéng)梅（1977-），女，廣西上思人，副研究員，研究方向：甘蔗栽培與分子生物學(xué)，E-mail：huangchengmei@gxaas.net。