方義++覃璐曼++劉侃++張南剛

摘要：介紹了一種可開啟微流控芯片?；诩?xì)胞的物理尺寸特性該芯片可對(duì)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulatetumorcells，CTCs）進(jìn)行分選富集及單個(gè)細(xì)胞的提取?？砷_啟微流控芯片的結(jié)構(gòu)簡單，簡化了制作流程。該文以前列腺癌細(xì)胞PC3為目標(biāo)靶細(xì)胞，結(jié)合顯微切割原理，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該細(xì)胞分選富集、轉(zhuǎn)印及單個(gè)細(xì)胞的提取，從而提高了CTCs檢測的純度。本文主要研究了可開啟細(xì)胞捕獲芯片的制作及單個(gè)細(xì)胞提取的方法。結(jié)果表明該芯片可以高效捕獲到循環(huán)腫瘤細(xì)胞并且能從捕獲到的細(xì)胞中任意提取單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞，從而為后續(xù)探討腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)機(jī)制和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了很好的基礎(chǔ)與平臺(tái)。

關(guān)鍵詞：循環(huán)腫瘤細(xì)胞；可開啟微流控芯片；單細(xì)胞；轉(zhuǎn)印

中圖分類號(hào)：TP311 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-3044（2017）03-0229-03

Circulating Tumor Cell Capture and Single Cell Extraction Based on an Openable Microfluidic Chips

FANG Yi，QIN Lu-man，LIU Kan，ZHANG Nan-gang

（Wuhan Textile University，Wuhan 430073，China）

Abstract： An openable microfluidic chip is introduced，which is based on the physical size of the cells， for enriching the peripheral blood circulating cells （CTCs） and extract singlecell. The chip has simple structure and simplifies the production process. In this study， the prostate cancer cellsis used as the target cell， combined with the principle of micro-cutting， achieved the cell sorting enrichment， transfer and single cell extraction， thereby enhancing the CTCs detection purity. In this paper， we mainly study the fabrication of cell-capture chip and the method of single cell extraction. The results showed that the chip could efficiently capture the circulating tumor cells and could extract a single target cell from the captured cells， thus providing a good foundation and platform for the follow-up study of the biological mechanism and metastasis mechanism of tumor cells

Key words： circulating tumor cell；openable microfluidic chip； single cell； transfer

腫瘤是目前危害人類生命健康最嚴(yán)重的疾病之一。近20 年來，我國癌癥發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢[1]。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療方法可以預(yù)防原發(fā)腫瘤細(xì)胞的生長，但是越來越多生物學(xué)和臨床研究結(jié)果表明腫瘤患者致死的主要原因是由于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移而并非原發(fā)病灶。腫瘤轉(zhuǎn)移疾病所引起的死亡占實(shí)體瘤所致死亡的90%左右，因此腫瘤轉(zhuǎn)移的早期準(zhǔn)確檢測就顯得尤為重要[2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）是指脫離原發(fā)腫瘤病灶，侵襲并進(jìn)入淋巴管、血液等循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤癌癥患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，常用作腫瘤轉(zhuǎn)移的可靠生物標(biāo)志物檢測和預(yù)后監(jiān)測[3-4]。但是CTC在外周血中的含量極低，約109個(gè)細(xì)胞中才會(huì)發(fā)現(xiàn)1至10個(gè)，因此CTC的檢測及分離在技術(shù)實(shí)現(xiàn)上非常具有挑戰(zhàn)性[5]。就目前而言，主要面臨的兩大挑戰(zhàn)：捕獲效率和純度。

CTC檢測常用的方法主要有兩種[6-7]，一種是基于細(xì)胞的生物化學(xué)特性也就是特定抗原抗體[8]之間的反應(yīng)，另一種則是基于細(xì)胞的物理特性，如細(xì)胞間的物理特性差異，如尺寸[9]、形變[10]、密度[11]、磁性[12]等。前者應(yīng)用免疫學(xué)基本原理對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理，這種方法需要專業(yè)技術(shù)人員操作并且成本高、通量小，如常用的流式細(xì)胞儀（flowcytometry，F(xiàn)C）、CellSearch檢測系統(tǒng)等。由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性，因此對(duì)于分選富集的細(xì)胞而言有漏判的嫌疑，不能很好對(duì)未被特異性結(jié)合的細(xì)胞而有可能是腫瘤細(xì)胞的進(jìn)行捕獲及分析，也不能很好的對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行操作。后者利用癌細(xì)胞與正常細(xì)胞在物理特性對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)分析處理，這種方法原理簡單、成本低、通量大，但是對(duì)于分選富集到的細(xì)胞同樣存在單細(xì)胞分離及分析困難的問題。

針對(duì)以上兩點(diǎn)問題，本文采用了一種低成本、高效的可開啟微流控芯片來實(shí)現(xiàn)CTC的分選富集，并充分利用石蠟的轉(zhuǎn)印和芯片可開啟對(duì)細(xì)胞進(jìn)行提取。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1 微流控芯片的原理

基于細(xì)胞尺寸分選系統(tǒng)的基本設(shè)計(jì)如圖1所示。微流控芯片由高度連續(xù)變化的玻璃上蓋片、聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）構(gòu)成粘合層和含有凸臺(tái)的玻璃下蓋片構(gòu)成。設(shè)計(jì)的基本思路是：芯片捕獲區(qū)域主要由一個(gè)高度連續(xù)變化的區(qū)域構(gòu)成，當(dāng)混有CTCs健康人血樣流經(jīng)該區(qū)域時(shí)，由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞相比于正常細(xì)胞而言：細(xì)胞剛性較大不易變型，尺寸也比正常細(xì)胞（如紅細(xì)胞，血小板等）要大，因此CTCs會(huì)按照不同大小會(huì)停留在相應(yīng)高度的位置，一些比出口小的細(xì)胞（如紅細(xì)胞、血小板等）和剛性較小的細(xì)胞會(huì)隨著液體流走，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的分選富集。

圖1 細(xì)胞分離示意圖

1.2 芯片設(shè)計(jì)與制作

1.2.1 芯片設(shè)計(jì)

以75mm×25mm光學(xué)玻璃片為基片，制作上蓋片長為62mm，上端寬5mm，下端寬15mm，最高處60μm，最低處5μm的楔形溝道（圖2（b））；制作下蓋片長為68mm，上端寬19mm，下端寬9mm的凸臺(tái)（圖2（c））；出入口孔徑均為0.6mm，出口溝槽為寬為1mm，深度為0.2mm。

圖2 芯片設(shè)計(jì)

1.2.2 芯片的制作

首先使用耐刻蝕的膠膜制作出溝道的掩膜與凸臺(tái)的掩膜，然后采用濕法刻蝕的方法，制作出楔形溝道與凸臺(tái)，再使用JDLGC16_A8精雕機(jī)分別使用0.6mm單粒度磨頭、轉(zhuǎn)速7500rpm，吃刀深度0.02mm及1.0mm單粒度磨頭、轉(zhuǎn)速13000rpm，吃刀深度0.02mm在帶有楔形溝道的上蓋片上加工出入口、出口及出口溝道，再將加工好的上下蓋片在超聲清洗機(jī)中經(jīng)丙酮、無水乙醇及去離子水依次超聲清洗，通過電暈處理后再在去離子水中合在一起后放在80℃的熱臺(tái)上烘干所有水分，這時(shí)上蓋片與下蓋片這間已經(jīng)有一定的分子鍵合力。在烘干的過程中，將PDMS樹脂與固化劑按10：1的質(zhì)量比混合，充分?jǐn)嚢杈鶆?，除去所有的氣泡，待芯片烘干后將PDMS浸入至芯片凸臺(tái)周圍直到PDMS完全浸沒整個(gè)凸臺(tái)周圍，隨后將芯片置于80℃熱臺(tái)上30至60分鐘，待固化后去除芯片周圍多余的PDMS，這樣最終就得到了可開啟的微流控芯片。

1.3 芯片操作

前列腺癌細(xì)胞（PC3）細(xì)胞株的培養(yǎng)液為RPMI1640與胎牛血清以9：1的培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)于50mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱，溫度為37℃，二氧化碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，加入胰酶進(jìn)行消化，將洗滌后的PC3細(xì)胞用磷酸鹽（PBS）緩沖液按質(zhì)量比1：10進(jìn)行稀釋，取1ml于試管并加入FDA，使其終濃度為100 μg.ml-1，置于室溫30min，期間用移液槍吹打幾次以確保細(xì)胞與FDA染色試劑充分接觸，然后取終濃度為0.4%的PFA與細(xì)胞溶液按1：20的比例將染好色的細(xì)胞進(jìn)行固定，最后利用注射器吸取適量細(xì)胞溶液，通過保定蘭格微量注射泵以100μl/min的流速注入芯片，圖3為該芯片在通血時(shí)的圖片。10min后換用PBS緩沖液沖洗，然后依次通入75%、80%以及100%的乙醇，最后通入液態(tài)的低溫石蠟將所捕獲到的細(xì)胞封閉在楔形溝道里。

接下來將捕獲到細(xì)胞的芯片放置于顯微鏡中，隨機(jī)取點(diǎn)觀察細(xì)胞的位置及數(shù)量，再將芯片放置于42℃的水中，用刀片將芯片分開，這里就可以得到完整包含石蠟的下蓋片與上蓋片。對(duì)完整包含石蠟的下蓋片進(jìn)行觀察，可以看到，隨機(jī)取到的點(diǎn)中的細(xì)胞位置及數(shù)量。

單細(xì)胞提取采用以下步驟：

1）石蠟的去除。取微量的環(huán)保脫蠟劑于待取細(xì)胞區(qū)域，然后開啟加熱裝置，通過顯微鏡的輔助，可以看到細(xì)胞在脫蠟過程中并沒有發(fā)生移動(dòng)。2）定位。將顯微注射針移動(dòng)至想要取出的細(xì)胞旁，之前需要吸入微量的PBS磷酸緩沖溶液。3）目標(biāo)細(xì)胞的取出。通過微量注射器的抽拉帶動(dòng)PBS的進(jìn)出，最后通過PBS的流動(dòng)將目標(biāo)吸入注射針中。

圖 3 通血

2 結(jié)果與討論

可開啟微流控芯片的制備見圖4，制作簡單易操作。與傳統(tǒng)PDMS微流控芯片制作方法有所不同的是，CTCs細(xì)胞捕獲芯片省去了復(fù)雜微流溝道模具的制作直接采用耐腐蝕的膠膜覆蓋保護(hù)區(qū)，溝道直接在蓋片上一次制成。傳統(tǒng)方法制作出來的微流控芯片在制作出來后就以成型，是不可逆的過程，即使強(qiáng)行分開也不能保證芯片的完整性，更不能確保捕獲到細(xì)胞的原位性，而本文中芯片的優(yōu)點(diǎn)之一就是過程可逆即芯片可開啟，并且在開啟后能夠保證捕獲到的細(xì)胞在開啟前后仍然停留在同一個(gè)位置，確保了細(xì)胞提取的前提。芯片的另一大優(yōu)點(diǎn)在于它高度是連續(xù)變化的溝道，這使得只要細(xì)胞形變量的范圍在出口高度與入口高度之間都能一一被捕獲，且細(xì)胞近似的成線性分布。芯片溝道的寬度與傳統(tǒng)的微流控芯片相比由μm提升至mm，提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，這也使得在通量上也得到了提高，意味著可以節(jié)省更多的實(shí)驗(yàn)時(shí)間?？梢姡疚牟捎玫闹谱鞣椒ㄖ谱鞒鰜淼男酒哂锌砷_啟、開啟后細(xì)胞原位性、高通量及可重復(fù)使用四大特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的微流控芯片相比，該工藝流程簡單，制作步驟操作易學(xué)，能輕松制造出調(diào)試連續(xù)變化的結(jié)構(gòu)溝道，而對(duì)于傳統(tǒng)方法來講這是難以穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)的，這充分說明該工藝不僅具有形態(tài)多樣的優(yōu)勢，更能實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)工藝難以完成的任務(wù)，是對(duì)傳統(tǒng)工藝的一種有益的補(bǔ)充。

圖4 制作可開啟微流控芯片的工藝流程

制作好的芯片實(shí)物見圖5（a）為了測試芯片尺寸是否符合設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，本文取標(biāo)準(zhǔn)尺寸聚苯乙烯熒光微球（10μm）作為參照物驗(yàn)證芯片高度準(zhǔn)確性（圖5（b））。通過鈉燈的照射，可以得到薄膜干涉條紋（圖5（c）），此方法的測量精度可達(dá)1μm，條紋的彎曲度表示表面的平整度。圖5（c）可以看出明暗條紋間距相等且條紋可近似看作直線，這表明：第一，芯片的楔形結(jié)構(gòu)深度是由小到大線性遞增；第二，芯片刻蝕出來的表面接近平面。通過微球與干涉條紋的驗(yàn)證，可以得出芯片是符合當(dāng)初的設(shè)計(jì)參數(shù)。

圖5 芯片高度驗(yàn)證

進(jìn)樣速度的高低與通量決定了該芯片對(duì)細(xì)胞的捕獲效率. 為了確保芯片對(duì)細(xì)胞的捕獲效率不下降， 在盡可能地提高芯片通量的情況下， 本研究對(duì)細(xì)胞的最佳進(jìn)樣速度進(jìn)行了研究， 分別以50，100， 150， 200μl/min的流速往芯片通入PC3腫瘤細(xì)胞2ml，通過倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察（圖6）。通過對(duì)比，采用100μl/min流速是最為適宜的。為了確保芯片的穩(wěn)定性，本研究選用100μl/min的流速對(duì)含不同細(xì)胞數(shù)的2ml人造血進(jìn)行了捕獲實(shí)驗(yàn)（圖7）。

圖6 不同流速下的捕獲效率

圖7 不同數(shù)量癌細(xì)胞的捕獲效率

為了測試芯片是否能完整地將捕獲到的前列腺細(xì)胞完整的轉(zhuǎn)印出來及單個(gè)細(xì)胞的提取，在芯片操作過程中分別使用顯微鏡觀察并記錄下整個(gè)過程中的細(xì)胞數(shù)及位置。圖8中a、b、c、d、e和f分別是芯片捕獲到PC3癌細(xì)胞熒光圖、使用石蠟封片后細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞所在位置熒光圖、開啟芯片后細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞所在位置圖、開啟后芯片明場圖、微量注射針定位到目標(biāo)細(xì)胞和被捕獲到微量注射中的細(xì)胞圖（明場與熒光）。通過圖8中的圖a與圖b的對(duì)照可以看出細(xì)胞在經(jīng)過石蠟包裹時(shí)基本沒有改變細(xì)胞的數(shù)量和位置；圖b與圖c對(duì)照可以看出開啟前后細(xì)胞的數(shù)量和位置并沒有改變。這一結(jié)果證明捕獲到基本細(xì)胞能被無損地轉(zhuǎn)印出來。通過圖e和圖f可以得出，可以通過對(duì)轉(zhuǎn)印層的合理處理，可以提出轉(zhuǎn)印層中任意一個(gè)捕獲到的細(xì)胞，即單個(gè)細(xì)胞的提取。

圖8 熒光或明場采樣結(jié)果

3結(jié)論

本文介紹了一種基于細(xì)胞物理尺寸分選法的可開啟的楔形捕獲芯片的制作方法，并提出了一種新的單細(xì)胞提取方法，最后給出單細(xì)胞提取的結(jié)果。上述方法針對(duì)CTC檢測捕獲及提取得了較好的結(jié)果，這種方式有得利于對(duì)同一種癌細(xì)胞特異性進(jìn)行分析，也適用于疑似癌細(xì)胞而未被標(biāo)記上的細(xì)胞做單獨(dú)分析，在未來有望與微流控系統(tǒng)結(jié)合開發(fā)出便攜式產(chǎn)品，以推動(dòng)CTC檢測在實(shí)際生活中的應(yīng)用。

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