李衍荷, 李曉明, 徐 蕊, 李洪雷, 王斌貴

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海洋紅樹林植物鹵蕨內(nèi)生真菌MA- 318中一個新的鏈烯酸酐衍生物methylate cordyanhydride A

李衍荷1, 2, 李曉明1, 徐 蕊1, 2, 李洪雷1, 2, 王斌貴1

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所 實驗海洋生物學(xué)重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

從采自海南東寨港的紅樹林鹵蕨(Linn)中分離得到的一株內(nèi)生真菌MA-318, 對其次級代謝產(chǎn)物進行了研究。利用反相硅膠柱層析、正相硅膠柱層析以及葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析等分離手段獲得一個單體化合物。通過波譜數(shù)據(jù)分析(HRESIMS、1D NMR、2D NMR)鑒定該化合物為新的鏈烯酸酐, 其結(jié)構(gòu)為methyl ()-3-(4-(2-((4-(but-1-en-1-yl)-2,5- dioxo-2,5-dihydrofuran-3-yl)methyl)butyl)-2,5-dioxo-2, 5-dihydrofuran-3-yl)propanoate, 命名為methylate cordyanhydride A。抗菌實驗表明該化合物對藤黃微球菌()表現(xiàn)出一定的抑制作用。

紅樹林; 內(nèi)生真菌; 化學(xué)成分; 結(jié)構(gòu)鑒定; 抗菌活性

天然產(chǎn)物是藥物研發(fā)先導(dǎo)化合物的重要來源[1]。其中, 來自特殊生態(tài)位的微生物, 例如海洋內(nèi)生共生體, 為了適應(yīng)海洋生態(tài)系統(tǒng)的特殊生活環(huán)境(高鹽、高壓、低氧、低光、營養(yǎng)限制等)[2], 在長期進化剛才中形成了獨特的生物代謝途徑, 能夠產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、具有良好生物活性的天然產(chǎn)物[3]。近年來我們系統(tǒng)開展了海洋生物天然產(chǎn)物研究, 發(fā)現(xiàn)、報道了一系列分子多樣性豐富的海洋天然產(chǎn)物, 若干化合物具有顯著的抗腫瘤、抗菌活性[4-6]。

本文報道從紅樹林植物鹵蕨(Linn)中分離得到的一株內(nèi)生真菌MA-318的化學(xué)成分研究。從該菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到一個新的鏈烯酸酐類成分, 通過波譜數(shù)據(jù)分析鑒定其結(jié)構(gòu)為methyl ()-3-(4-(2-((4-(but- 1-en-1-yl)-2,5-dioxo-2,5-dihydrofuran-3-yl)methyl)butyl)- 2,5-dioxo-2,5-dihydrofuran-3-yl)propanoate, 命名為methyate cordyanhydride A, 在其長直鏈上含有2個順丁烯二酸酐結(jié)構(gòu)單元(圖1)。

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

核磁共振圖譜由Bruker Avance 500核磁共振儀測定, TMS為內(nèi)標; 質(zhì)譜數(shù)據(jù)由API QSTAR Pulsar 1質(zhì)譜儀測定; 薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠(200~ 300目)為青島海洋化工廠分廠產(chǎn)品; Lobar LiChroprep RP-18硅膠 (40~63 μm, Merck); 顯色劑為茴香醛硫酸溶液; 所用有機溶劑為重蒸的工業(yè)級溶劑。

1.2 菌株發(fā)酵

(1) 菌株: 菌株MA-318分離自2015年3月采集自海南東寨港的鹵蕨(Linn)。通過形態(tài)學(xué)觀察與ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析[7], 將該菌株鑒定為。

(2) 菌株發(fā)酵: 菌種于–80℃以20% 甘油-水保存。發(fā)酵采用改良PDB培養(yǎng)基, 組成為: 蔗糖6.0 g, 甘露醇6.0 g, 蛋白胨1.5 g, 酵母浸粉0.9 g, 含20%土豆汁的純海水300 mL。

采用1 L三角瓶發(fā)酵培養(yǎng), 每瓶裝液體培養(yǎng)基300 mL, 于116℃滅菌30 min后接種。共接種液體培養(yǎng)基18 L, 于28℃恒溫、自然光條件下培養(yǎng)30 d, 分別收集菌絲體和發(fā)酵液。

1.3 提取分離

收集發(fā)酵液約18 L, 用乙酸乙酯萃取。菌絲體晾干、粉碎后用丙酮︰水(4︰1)浸泡。將丙酮蒸出, 水相用乙酸乙酯萃取, 萃取物經(jīng)薄層層析檢測發(fā)現(xiàn)與發(fā)酵液萃取物一致, 合并得粗提物39.7 g。

將上述粗提物進行硅膠柱層析, 以石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇體系梯度洗脫, 經(jīng)TLC檢測合并為9個組分(Fr.1-9)。其中組分Fr.5經(jīng)反相硅膠柱層析(甲醇—水從10︰90到90︰10梯度洗脫)、Sephadex LH-20凝膠柱層析(甲醇)及正相硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯20/1到5/1梯度洗脫)分離得到化合物1(20.9 mg)。

1.4 抑菌活性MIC測試

(1) 病原指示菌: 抗菌活性所使用的病原指示菌包括大腸桿菌(), 藤黃微球菌(), 銅綠假單胞菌(), 遲緩愛德華氏菌(), 副溶血性弧菌()和哈氏弧菌(), 以上所有供試菌株均來自于中國科學(xué)院海洋研究所。

(2) 指示菌菌懸液制備: 將接種于LB培養(yǎng)基表面的指示菌于37℃培養(yǎng)24 h后, 吸取2 mL無菌0.85% NaCl溶液洗滌培養(yǎng)物, 并用刮刀將菌刮下。吸取適量菌懸液于無菌試管中, 然后用0.85% NaCl溶液將菌懸液調(diào)至0.5麥氏濁度(相當(dāng)于1.5×108CFU/mL),備用。

(3) 抑菌活性MIC測試: 采用微量肉湯稀釋法[8], 測定化合物的抗菌活性。采用無菌操作, 以氯霉素為陽性對照, 將梯度稀釋后不同濃度的樣品溶液分別加到無菌的96孔聚苯乙烯板中(每孔5 μL)。然后取95 μL麥氏濁度為0.5的指示菌懸液, 依次加入到96孔板中。輕輕震蕩后, 將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中, 培養(yǎng)24 h, 在600 nm波長下使用酶標儀測定每孔的吸光值, 以完全抑制指示菌生長的最低樣品濃度為該化合物的MIC值。

2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

3 化合物的抗菌活性

化合物1是已知化合物cordyanhydride A的甲酯化產(chǎn)物[9], 迄今為止未見該類化合物的活性報道。我們對分離得到的化合物1進行了抗菌活性測試, 受試菌包括大腸桿菌(), 藤黃微球菌(), 銅綠假單胞菌(), 遲緩愛德華氏菌(), 副溶血性弧菌()和哈氏弧菌()。測試結(jié)果表明化合物1對藤黃微球菌表現(xiàn)出一定的抑制活性, 其MIC值為16 μg/mL(陽性對照氯霉素的MIC值為4 μg/mL)。

圖2 化合物1的HMBC以及1H-1HCOSY相關(guān)

表1 化合物1的1H-(500 MHz)和13C-NMR(125 MHz)數(shù)據(jù)(DMSO-d6)

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(本文編輯: 康亦兼)

Methylate cordyanhydride A, a new alkenoic anhydride fromMA-318, an endophytic fungus derived from the marine mangrove plant

LI Yan-he1, 2, LI Xiao-ming1, XU Rui1, 2, LI Hong-lei1, 2, WANG Bin-gui1

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The biochemical investigation ofMA-318, an endophytic fungus isolated from the mangrove plantLinn, resulted in the identification of a new alkenoic anhydride, methylate cordyanhydride A. Spectroscopic methods were used to elucidate the structure of this compound. Regarding the antimicrobial activity, this compound was found to possess moderate activity against, with an MIC value of 16 μg/mL.

Mangrove; endophytic fungus; chemical constituents; structure elucidation; antimicrobial activity

Mar. 7, 2017

李衍荷(1992-), 女, 山東青島人, 碩士研究生, 主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究; 王斌貴,

, 電話: 0532-82898553, E-mail: wangbg@ms.qdio.ac.cn

O629

A

1000-3096(2017)09-0110-04

10.11759/hykx20170307003

2017-03-07;

2017-04-24

國家自然科學(xué)基金項目(31570356)

[National Natural Science Foundation of China, No.31570356]