于清淼，王 平，劉東波，趙洪巖，邵緩緩，馬 喆，霍洪亮

(1.東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，吉林 長春 130117；2.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024)

17β-雌二醇降解菌紅球菌(Rhodococcussp.)DS201的分離鑒定及其特性研究

于清淼1，2，王 平3，劉東波3，趙洪巖3，邵緩緩1，馬 喆1，霍洪亮1

(1.東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，吉林 長春 130117；2.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024)

從北京一藥廠曝氣池的活性污泥中馴化、分離得到一株能以17β-雌二醇為唯一碳源生長的高效降解菌DS201.經(jīng)過對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA序列分析，初步鑒定為紅球菌Rhodococcussp.分析了溫度、pH值、接種量、底物濃度等因素對DS201生長的影響.結(jié)果表明：DS201生長的最適溫度為30℃，最適pH=7，最佳接種量為2%，最適底物濃度為5 mg/L.通過正交實(shí)驗(yàn)分析，DS201降解17β-雌二醇的最優(yōu)條件是：溫度30℃，pH=7，接種量為1%；培養(yǎng)3 d能使1 mg/L 17β-雌二醇完全降解.通過質(zhì)譜分析，17β-雌二醇的初級降解產(chǎn)物是雌酮.

17β-雌二醇；紅球菌屬；生物降解；雌激素活性

17 β-雌二醇(17 β-estradiol，E2)是一種天然雌激素，也是典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，在我國內(nèi)陸水系和近海水體中均能檢測到其存在.長江和太湖中E2濃度都在0.1 ng/L以上[1-2].天然雌激素污染對人或動(dòng)物生長、發(fā)育危害極大.對水生生物的影響表現(xiàn)為雄性雌性化或雌雄同體、發(fā)育異常甚至死亡等.對人的影響表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)發(fā)育異常和生殖障礙，致畸和致癌等[3-5].Biegel等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，生活在E2污染環(huán)境中的成年小鼠卵巢和睪丸發(fā)育均不正常；Vajda等[7-9]研究發(fā)現(xiàn)，生長在含有E2廢水的魚類出現(xiàn)生殖異常.此外，有研究還表明，E2污染與女性乳腺癌和男性前列腺癌、睪丸癌發(fā)病率的增加都有直接關(guān)系[10].

在眾多的天然雌激素中，E2被認(rèn)為是潛在的危害最大的一類雌激素，主要通過人和生物體的尿液以及工廠廢水排放進(jìn)入環(huán)境中，極低濃度水平(0.l ng/L) 的 E2便可造成明顯的影響[3，7].目前，降解污染水體中的E2已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題，很多學(xué)者對E2在環(huán)境中的分布、遷移和轉(zhuǎn)化等問題開展了一系列研究，也分離和鑒定出一些能夠降解E2的菌株，例如Fujisawa[11]分離出的E2降解菌Novosphingobiumsp.(ARI-1)等，但有關(guān)紅球菌的E2降解特性以及對E2降解條件優(yōu)化的研究尚未見報(bào)道.

本研究從北京一藥廠曝氣池的活性污泥中馴化、分離獲得一株能以E2為唯一碳源和能源生長的細(xì)菌，經(jīng)初步鑒定為紅球菌(Rhodococcussp.)，對該菌株的E2降解特性、降解條件和降解產(chǎn)物進(jìn)行了研究，初級降解產(chǎn)物為雌酮.該項(xiàng)研究將為天然雌激素類降解的生物處理提供新的菌株材料，為構(gòu)建和強(qiáng)化E2降解工程菌提供理論依據(jù)和試驗(yàn)參數(shù).

1 材料與方法

1.1 試劑

17 β-雌二醇(E2)為Sigma公司生產(chǎn)，色譜純(純度大于98%).其他藥品均為分析純.

1.2 樣品來源與培養(yǎng)基

樣品來自北京某生產(chǎn)避孕藥工廠的曝氣池泥樣.

無碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基為：NaHPO44.26 g/L，KH2PO42.65 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，CaCl20.02 g/L.用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調(diào)pH=7.0.加入1 mL的微量元素，用蒸餾水定容至1 000 mL.

圖1 17β-雌二醇化學(xué)結(jié)構(gòu)式

微量元素為：NiCl2·6H2O 0.024 g/L，CoCl2·6H20 0.19 g/L，H3BO30.006 g/L，ZnCl20.07 g/L，CuCl2·2H2O 0.002 g/L，MnSO4·H2O 0.061 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.024 g/L.

LB培養(yǎng)基為：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)pH=7.4.固體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂.

碳源：17β-雌二醇，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1.

1.3 E2降解菌的富集、篩選和純化

將實(shí)驗(yàn)所用各種玻璃器皿用蒸餾水洗凈備用.配制質(zhì)量濃度為500 mg/L的E2母液，取1 mL母液加入到盛有100 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的三角瓶中，使無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中E2的終濃度為5 mg/L.將三角瓶放入到恒溫水浴箱中，60℃水浴30 min，使甲醇完全蒸發(fā)，高壓滅菌.將泥樣按1∶10的體積比加入到液體培養(yǎng)基中，并加入體積比1∶10的實(shí)際污水，在30℃，120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.從每瓶培養(yǎng)基中取200 μL菌液加入到新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)7 d.按此法將菌液接種到含有E2質(zhì)量濃度為20，40，60，80，100 mg/L的新鮮無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(重復(fù)3次).

選擇E2降解率最高的樣品，取1 mL菌液用無菌水從10-2逐級稀釋至10-8，在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，做3個(gè)平行組.培養(yǎng)3 d，觀察菌落.用接種環(huán)挑取長勢好的菌落在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行多次劃線，直至分離出單個(gè)菌落.然后將單菌落接種到以E2為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，用試管斜面將能降解E2的單菌落4℃保存.

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察菌落的形態(tài)特征[12]，測定菌落的外形大小，并對細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色.

1.4.2 生理生化指標(biāo)

生理生化實(shí)驗(yàn)參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[14].

1.4.3 菌株16S rDNA鑒定

參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》，用細(xì)菌的通用引物通過PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增DNA.

上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

下游引物1492R：5′-TACCTTGTTACGATT-3′.

測序結(jié)果利用NCBI中的blast工具與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比較.并用軟件MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 菌懸液的制備

將菌液在30℃，120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.用滅過菌的離心管4 000 r/min離心15 min，倒去上清液；加入pH=7的磷酸鹽緩沖溶液洗滌，4 000 r/min再次離心15 min，倒去上清液.如此反復(fù)洗滌3次.用漩渦混合器將菌體打散，再用磷酸鹽緩沖溶液將菌液稀釋到D(600)的值為1.0，制成菌懸液備用.

1.6 E2降解菌特性研究

處理溫度設(shè)定為4℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃；pH值設(shè)定為：4，5，6，7，8，9，10，11；E2質(zhì)量濃度設(shè)定為：0.5，1，5，10，40，60，80，100，150，200 mg/L；菌種初始接種量為：1%，2%，3%，5%，7%，9%，12%.研究菌株生長特性和E2降解特性.每個(gè)影響因素設(shè)置3個(gè)平行組，以不接菌的培養(yǎng)基作為空白對照.將菌株在30℃，120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測定在不同影響因素下的E2降解率和D(600).選用五因素四水平正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn).

1.7 降解物及濁度分析與檢測

將樣品用乙醚等體積萃取，重復(fù)3次.萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干，甲醇定容.0.22 μm濾膜過濾后加入色譜瓶.用高效液相色譜儀(HPLC，Wasters1525)測定雌激素濃度，檢測器為UV(DualλAbsorbance Detector，Water2487)，色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18柱(150 mm × 4.6 mm，3.5 mm).流動(dòng)相體積比為V(乙腈)∶V(水)=1∶1，檢測器波長為275 nm，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次，取平均值.樣品的濁度用酶標(biāo)儀在600 nm處檢測，用吸光度(D(600))表示.

E2初級降解產(chǎn)物用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)測定.高效液相色譜的測定條件如上所述；質(zhì)譜測定條件：API2000質(zhì)譜儀，ESI源，負(fù)離子掃描，蒸汽溫度400℃，毛細(xì)管溫度200℃，以不接菌株的樣品作為對照.

2 結(jié)果

2.1 E2降解菌的分離

圖2 菌株DS201電鏡照片

樣品富集馴化8周后，分離出20株能夠以E2為唯一碳源和能源生長的細(xì)菌.用高效液相色譜儀測定20株細(xì)菌對E2的降解率，用酶標(biāo)儀測定吸光度.綜合E2降解率和濁度優(yōu)選出1株最佳菌株，命名為DS201，將其作為后續(xù)研究菌種.

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)

菌株DS201在LB培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，表面圓潤，邊緣完整，粉色，不透明，直徑1.5～3.0 mm，革蘭氏染色陽性.掃描電鏡觀察，菌株DS201的形態(tài)呈球形，無鞭毛(見圖2).

菌株DS201的生理生化特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.

2.2.2 16S rDNA鑒定

將菌株DS201的16S rDNA的基因序列輸入到NCBI在線blast比對程序與GenBank基因庫中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對檢索.比對結(jié)果表明，菌株DS201的16S rDNA基因序列與GenBank基因庫中的紅球菌屬(Rhodococcus)中的多株紅球菌和馬紅球菌的16S rDNA的基因序列有99%以上的同源性，結(jié)合菌株DS201的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)，初步確定菌株為紅球菌，命名為紅球菌(Rhodococcussp.)DS201.選取紅球菌屬中的18個(gè)菌株的16S rDNA基因序列，并選取分枝桿菌屬(Mycobacterium)中的2個(gè)菌株16S rDNA基因序列做外群，使用MEGA軟件并根據(jù)Neighbor-Joining進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，構(gòu)建的無根系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3.

圖3 菌株DS201的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 DS201 E2降解特性

溫度對菌株DS201降解E2的影響：菌株DS201隨著溫度的升高降解E2的能力明顯提高.當(dāng)溫度到達(dá)30℃時(shí)，E2降解率達(dá)到最高.溫度再升高，E2降解率逐漸下降.說明菌株DS201 E2降解最適溫度為30℃(見圖4a).

圖4 菌株DS201降解E2特性

pH值對菌株DS201降解E2的影響：菌株DS201在pH=4時(shí)，降解率很低；在pH=6～8時(shí)，降解率較高；在pH=7時(shí)，降解率最高.說明菌株DS201的E2降解最適初始pH=7(見圖4b).

底物濃度對菌株DS201降解E2的影響：當(dāng)E2的質(zhì)量濃度為0.5～5 mg/L時(shí)，降解率隨著濃度增加逐漸升高；當(dāng)E2的質(zhì)量濃度為5～60 mg/L時(shí)，E2的降解出現(xiàn)一定程度的抑制；當(dāng)E2的質(zhì)量濃度為60～200 mg/L時(shí)，E2的降解雖然受到一定程度的抑制，但隨著濃度的增加不再出現(xiàn)明顯下降的情況.說明該菌株具有較強(qiáng)的抵抗生物毒性的能力.菌株DS201降解E2的最適底物質(zhì)量濃度為5 mg/L，降解率達(dá)到89.1%；在質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，降解率為39.2%(見圖4c).

接種量對菌株DS201降解E2的影響：當(dāng)菌株DS201的接種量在2%時(shí)，E2的降解率最高，隨著接種量的增加，E2的降解率受到明顯抑制.說明菌株DS201降解E2的最適接種量為2%(見圖4d).

選擇溫度、pH、底物質(zhì)量濃度和接種量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn).對正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表2.

表2 菌株DS201降解E2條件優(yōu)化的極差分析

由表2的極差分析可知，溫度對菌株DS201降解E2的影響最大，隨著溫度的變化平均降解率出現(xiàn)明顯變化，30℃平均降解率最高.底物濃度對菌株DS201降解E2的影響次之，隨著底物濃度的升高，平均降解率先升高再降低，底物質(zhì)量濃度為1 mg/L的平均降解率最大.再次是pH對菌株DS201降解E2的影響，在偏酸和偏堿環(huán)境中E2的平均降解率都沒有中性環(huán)境的降解率高.最后是接種量對菌株DS201降解E2的影響，隨著接種量的增加，E2的平均降解率下降，這可能是營養(yǎng)物質(zhì)的量限制了菌株E2的降解能力.

將正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用軟件SPSS(statistical product and service solutions)進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異顯著，結(jié)果見表3.由表3可見，溫度和底物質(zhì)量濃度對DS201降解E2的影響特別顯著，pH對DS201降解E2的影響非常顯著，而接種量對DS201降解E2的影響顯著.所以，因素主次順序?yàn)椋簻囟取孜镔|(zhì)量濃度—pH—接種量.結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)的極差分析和方差分析，以降解率為指標(biāo)，菌株DS201降解E2的最優(yōu)水平組合為溫度(3)-底物濃度(2)-pH(3)-接種量(1)，即溫度為30℃、底物質(zhì)量濃度為1 mg/L、pH=7、接種量為1%時(shí)，降解率達(dá)到最高.

表3 菌株DS201降解E2條件優(yōu)化的方差分析

aR2=0.996.

2.4 中間代謝產(chǎn)物測定

用HPLC-MS/MS檢測菌株DS201降解E2的代謝產(chǎn)物，測得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5.

圖5 菌株DS201降解E2中間產(chǎn)物的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果

續(xù)圖5

圖5a的5號峰和圖5b的5號峰為E2峰，保留時(shí)間為9.7 min.通過比較圖5a與圖5b，推測圖5b的7號峰為中間代謝產(chǎn)物峰.對圖5b的5號峰和7號峰進(jìn)行質(zhì)譜檢測，結(jié)果見圖5c和圖5d.對比這兩幅質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)荷質(zhì)比為269.1的物質(zhì)可能為代謝產(chǎn)物，因此對其進(jìn)行二級質(zhì)譜檢測，結(jié)果見圖5e.由圖5e可見，荷質(zhì)比為269.1的物質(zhì)是一個(gè)完整的物質(zhì)，故確定其為E2的初級代謝產(chǎn)物.將該物質(zhì)的相對分子質(zhì)量為270輸入NIST Chemistry WebBook 數(shù)據(jù)庫，找到對應(yīng)的物質(zhì)，并結(jié)合E2化學(xué)鍵斷鍵和成鍵規(guī)律，確定E2的初級代謝產(chǎn)物為雌酮(estrone，E1).

3 結(jié)論

從北京某生產(chǎn)避孕藥工廠的曝氣池活性污泥中馴化、分離得到20株能以17 β-雌二醇為唯一碳源生長的降解菌株，經(jīng)過進(jìn)一步篩選，得到了一株降解率高且穩(wěn)定的降解菌DS201.經(jīng)過對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)以及16S rDNA序列分析，初步鑒定該菌株為紅球菌(Rhodococcussp.).通過單因素實(shí)驗(yàn)得到了DS201最適的降解條件為：溫度30℃、pH=7、最佳接種量為2%、底物濃度為5 mg/L.通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化降解條件，結(jié)果表明，菌株DS201在溫度30℃，pH=7，接種量1%，培養(yǎng)3 d能夠完全降解底物質(zhì)量濃度為1 mg/L的17 β-雌二醇.通過HPLC-MS/MS聯(lián)用鑒定出17 β-雌二醇的初級代謝產(chǎn)物是雌酮.

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(責(zé)任編輯：方 林)

Isolation，identification of 17 β-estradiol-degradingRhodococcussp.strain DS201 and its degradation characteristics

YU Qing-miao1，2，WANG Ping3，LIU Dong-bo3，ZHAO Hong-yan3， SHAO Yuan-yuan1，MA Zhe1，HUO Hong-liang1

(1.School of Envionment，Northeast Normal University，Changchun 130117，China； 2.School of the Environment，Nanjing University，Nanjing 210023，China； 3.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China)

A novel bacterium capable of degrading 17 β-estradiol(E2) was isolated from the activated sludge collected from wastewater treatment plant of pharmacy factory mainly producing contraceptive medicine in Beijing.According to its morphology，physiochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis，this strain was identified asRhodococcussp. By tests in shaking flasks，the effects of the conditions of growth was studied，and it was determined that the optimum conditions of growth for the strain was 30℃，pH=7 and inoculum amount 2% and E2 initial concentration of 5 mg/L.The degrading conditions for strain DS201 was further optimized by tests in orthogonal tests.The results showed that the conditions for the degradation of E2 by strain DS201 were 30℃，initial pH=7，and inoculum amount 1%，this strain could degrade E2 completely within 3 d with intial concentration of 1 mg/L.Mass spectrum analysis demonstrated estrone that the main catabolic intermediates during E2 degradation.

17 β-estradiol；Rhodococcussp；biodegradation；estrogenic activities

1000-1832(2017)01-0140-08

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.01.026

2015-11-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51478096).

于清淼(1990—)，男，博士研究生；通訊作者：霍洪亮(1963—)，男，教授，主要從事污水處理與資源化研究.

X 799.3 [學(xué)科代碼] 610·30

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