何亞鵬，鮑長磊，張 琪，付明哲，許信剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小反芻獸疫病毒疫苗株N和M基因的克隆、序列分析及原核表達

何亞鵬，鮑長磊，張 琪，付明哲，許信剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

根據(jù)GenBank已登錄的PPRV基因組序列，設(shè)計并合成2對特異性引物，以PPRV疫苗株基因組為模板，經(jīng)RT-PCR擴增獲得N和M基因并進行序列分析，再將2個基因插入到原核表達載體pET-28a中，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞進行IPTG誘導(dǎo)表達，并進行SDS-PAGE和Western blot檢測。成功克隆PPRV疫苗株N和M基因，重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達分子質(zhì)量為57.7 ku N蛋白(核衣殼蛋白)和38.1 ku的M蛋白(基質(zhì)蛋白)，2個蛋白均能與小反芻獸疫陽性血清特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性。

小反芻獸疫毒；N基因；M基因；克??；序列分析；原核表達

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits virus,PPRV)引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，主要感染山羊、綿羊和鹿等小反芻動物，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為必須通報的動物傳染病，中國將其列為一類動物疫病[1]。PPRV是副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)的成員。PPRV的基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，從3′至5′依次是N-P-M-F-H-L6個基因，編碼8種相應(yīng)的蛋白，分別為核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、囊膜基質(zhì)蛋白(M)、纖突糖蛋白(F)、血凝素蛋白(H)及2個非結(jié)構(gòu)蛋白(C和V)[2-3]。N基因全長1 674 bp，包含1個開放性閱讀框(ORF)，編碼525個氨基酸，其編碼的N蛋白在病毒蛋白中含量最高，同時也是核蛋白核心的主要組成元素，與RNA緊密結(jié)合，保護核酸，其被認(rèn)為在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起主要作用[4]。M基因全長1 466 bp，含1個ORF，編碼335個氨基酸，M蛋白有形成病毒囊膜的內(nèi)層，與病毒的成熟釋放有關(guān)[5-6]。中國2007年暴發(fā)小反芻獸疫疫情[7]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，近期中國境內(nèi)又有小反芻獸疫的發(fā)生[8-9]。目前，針對小反芻獸疫尚無有效的治療手段，主要靠疫苗進行防控。疫苗免疫后免疫效果如何？需要進行抗體水平的檢測。因此，建立快速有效的抗體檢測方法就顯得尤為重要。本試驗對小反芻獸疫的N和M基因進行克隆并原核表達，為下一步小反芻獸疫基因工程疫苗的開發(fā)、單克隆抗體的制備及抗體快速診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒、菌種和質(zhì)粒 PPRV疫苗株(Nigeria 75 /1株)為新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；pEASY-T1 Cloning Kit、感受態(tài)細胞Trans5a、原核表達菌株BL21為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pET-28a質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 FastQuant RT Kit、Trizol Reagent為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；2×EsTaqMasterMix、DM2000 DNA Marker、Super DNA Marker、廣譜蛋白Marker購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Blue plus Ⅱ Protein Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；各種內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購于NEB公司；血液/組織/細胞基因組提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；IPTG購自Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 血清 PPRV陽性血清為采自臨床免疫過PPRV弱毒疫苗(Nigeria 75 /1株)的羊血清。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中收錄的PPRV全基因序列，并參考國內(nèi)外相關(guān)文獻[3-4,6]，利用Primer 5.0引物分析軟件設(shè)計引物，用于擴增PPRV的N基因(N-F/N-R)和M基因(M-F/M-R)，N基因上游引物5′- CCGGAATTCGCTACTCTCCTTAAAAGCTTGGCAT -3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點)，下游引物5′- CCGCTCGAGGCTGAGGAGATCCTTGTCGT- TGTAG-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)，目的片段為1 578 bp；M基因上游引物5′- CCGGGATCCACCGAGATCTACGATTTTGATAA- AT -3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點)，下游引物5′- CCGCTCGAGCAGGATCTTGAACAGGCCTTGATCA -3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)，目的片段為1 008 bp。引物由Invitrogen上海貿(mào)易有限公司合成，-20℃保存，備用。

1.2.2N和M基因的擴增與克隆 取PPRV疫苗株稀釋液200 μL，用Trizol Reagent說明書方法提取RNA，以提取的基因組RNA為模板，按照PrimeScript RT reagent Kit試劑盒說明書將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增N和M基因。膠回收N、M目的基因片段，連接至pEASY-T1載體并轉(zhuǎn)化克隆感受態(tài)細胞，PCR鑒定，提取陽性質(zhì)粒并命名為pEASY-T1-N、pEASY-T1-M。

1.2.3 原核表達載體的構(gòu)建及鑒定EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pEASY-T1-N及pET-28a空質(zhì)粒；BamHⅠ 和XhoⅠ雙酶切pEASY-T1-M及pET-28a空質(zhì)粒；瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切產(chǎn)物。T4連接酶將回收的N和M目的片段與對應(yīng)相同酶切的pET-28a線性化質(zhì)粒于16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆感受態(tài)細胞Trans5α中。挑取單克隆后擴大培養(yǎng)，分別進行PCR和雙酶切鑒定后送華大基因(北京)測序。

1.2.4 重組蛋白N和M的誘導(dǎo)表達及表達條件的優(yōu)化 將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET28a-N和pET28a-M以及pET-28a空載體分別轉(zhuǎn)化表達感受態(tài)細胞BL21，挑取單克隆，37 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)，按φ=1%轉(zhuǎn)接5 mL新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)后3、4、5、6、7 h收集菌體，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 重組蛋白的Western blot分析 將重組蛋白表達產(chǎn)物進行常規(guī)SDS-PAGE后，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h。以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h，分別以1∶500倍稀釋的PPRV陽性血清4 ℃孵育PVDF膜過夜。TBST振蕩洗滌3次，每次15 min。將PVDF膜以1∶5 000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體室溫孵育2 h，TBST振蕩洗滌3次，每次15 min。ECL反應(yīng)液孵育PVDF膜，暗室壓片曝光。同時設(shè)立陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

以PPRV疫苗株(Nigeria 75 /1株)提取的RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增得到1 578 bp的N基因和1 008 bp的M基因，與預(yù)期大小相符(圖1)。

M.DNA Marker DL2000；1.N基因擴增產(chǎn)物 Amplification ofNgene；2.M基因擴增產(chǎn)物 Amplification ofMgene

圖1N和M基因的擴增
Fig.1 Amplification ofNandMgene by PCR

2.2 原核重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pET28a-N經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)1 578 bp的目的條帶和5 369 bp的載體條帶。重組質(zhì)粒pET28a-M經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)1 008 bp的目的條帶和5 369 bp的載體條帶。同時雙酶切pET-28a載體作陰性對照，載體條帶與陰性對照大小相同，目的條帶與PCR鑒定相符，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖2)。

M.DNA Marker DL10000；1.pET-28a 經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切 pET-28a digested usingEcoRⅠandXhoⅠ；2.pET28a-N經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切 pET28a-Ndigested usingEcoRⅠandXhoⅠ；3.N基因擴增產(chǎn)物 Amplification ofNgene；4.pET-28a 經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切 pET-28a digested usingBamH ⅠandXhoⅠ；5.pET28a -M經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切 pET28a-Mdigested usingBamH ⅠandXhoⅠ；6.M基因擴增產(chǎn)物 Amplification ofMgene

圖2 重組表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定
Fig.2 Digestion identifications of recombinant plasmid

2.3N和M基因的序列分析及編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)預(yù)測

測序結(jié)果表明，該N和M序列與Nigeria 75/1的核苷酸序列100%符合，表明基因克隆正確。利用Internet在線軟件預(yù)測N和M基因編碼的氨基酸序列。結(jié)果表明，N和M氨基酸序列均沒有信號肽和跨膜區(qū)。對N基因編碼蛋白的親水性分析表明，N基因編碼的核衣殼蛋白在10～23、120～164、184～230、240～251、399～467、471～495和504～525位的氨基酸殘基處有較高的親水性；由抗原表位分析圖可知，核衣殼蛋白在第10～21、44～70、83～101、106～114、119～127、132～147、182～230、239～252、318～328、340～361、366～377、398～415、421～466、471～494和503～525位可能存在抗原表位(圖 3)。對M基因編碼基質(zhì)蛋白的親水性分析表明，M基因編碼的基質(zhì)蛋白在4～13、23～32、42～49、59～69、82～97、149～158、163～181、196～215、221～243、258～271、286～300和312～321位的氨基酸殘基處有較高的親水性；由抗原表位分析圖可知，基質(zhì)蛋白在第5～32、35～49、59～71、79～96、149～157、161～170、195～204、209～216、222～244、261～271、286～292和311～322位可能存在抗原表位(圖 4)。

2.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化

用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)不同時間(3～7 h)，SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示在誘導(dǎo)6 h后，重組蛋白N表達量顯著增加，在7 h時表達量最大(圖5)；誘導(dǎo)5 h后，重組蛋白M表達量顯著增加，在6 h時表達量最大(圖6)；pET-28a空質(zhì)粒對照組和pET28a-N和pET28a-M未誘導(dǎo)對照組均沒有重組蛋白的表達。

圖3 N蛋白氨基酸序列的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性分析Fig.3 Analysis of hydrophilicity,antigenic index and surface probability of N protein amino acid

圖4 M蛋白氨基酸序列的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性分析Fig.4 Analysis of hydrophilicity,antigenic index and surface probability of M protein amino acid

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein Marker；1.誘導(dǎo)pET-28a Induced cells containing pET-28a；2.未誘導(dǎo)pET28a-NUninduced cells containing pET28a-N；3～7.分別誘導(dǎo)3～7 h的pET28a-NCells containing pET28a-Ninduced for 3-7 h respectively

圖5 不同誘導(dǎo)時間對N重組蛋白表達的影響
Fig.5 Effects of different induction time on expression of N fusion protein

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein Marker；1.誘導(dǎo)pET-28a Induced cells containing pET-28a；2.未誘導(dǎo)pET28a-MUninduced cells containing pET28a-M；3～7.分別誘導(dǎo)3～7 h的pET28a-MCells containing pET28a-Minduced for 3-7 h respectively

圖6 不同誘導(dǎo)時間對M重組蛋白表達的影響
Fig.6 Effects of different induction time on expression of M fusion protein

2.5 重組蛋白的Western blot分析

Western blot結(jié)果顯示(圖 7)，N和M重組蛋白均能與小反芻獸疫陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，出現(xiàn)特異性條帶，而陰性對照轉(zhuǎn)染空載體pET-28a的重組菌與陽性血清不反應(yīng)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Blue plus Ⅱ Protein Marker；1.N重組蛋白 N fusion protein；2.M重組蛋白 M fusion protein；3.pET-28a對照菌 pET-28a control

圖7 N和M重組蛋白的Western blot結(jié)果
Fig.7 Western blot analysis of N and M fusion protein

3 討 論

本研究成功克隆PPRV疫苗株(Nigeria 75 /1)的N和M全長基因，測序結(jié)果與NCBI中Nigeria 75 /1的核苷酸序列100%相符合，證明N和M基因克隆正確。利用在線生物軟件預(yù)測N、M蛋白序列，分析表明N和M蛋白均沒有信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域；親水性分析表明，N和M基因編碼的蛋白均有較高的親水性；由抗原表位分析表明，N和M基因編碼的核心蛋白存在多個可能抗原表位。綜合分析表明，N基因編碼的核衣殼蛋白和M基因編碼的基質(zhì)蛋白均具有較強的抗原性和親水性，且抗原性峰值和親水性峰值基本同步。N和M基因編碼的蛋白具有良好的抗原性，成為臨床上診斷PPRV感染的理想抗原，必將在PPRV的診斷及血清學(xué)調(diào)查中發(fā)揮巨大作用。

大腸埃希菌表達系統(tǒng)具有方便、高效、簡單、可操作性強等優(yōu)點。pET-28a(+) 為高效表達載體，pET-28 a(+)中的His標(biāo)簽蛋白在純化過程中起到很重要的作用，為今后的蛋白純化提供保障[4]。本試驗將N和M基因克隆于pET-28a原核表達載體T7啟動子的下游，與His-tag同框融合，構(gòu)建原核表達載體，并在宿主菌BL21中成功誘導(dǎo)表達N和M蛋白。在誘導(dǎo)表達的過程中，通過對誘導(dǎo)劑的濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間的調(diào)節(jié)，最終確定誘導(dǎo)表達的最佳條件為37 ℃，IPTG的終濃度為 1 mmol /L、220 r/min、誘導(dǎo)7 h獲得PPRV N抗原蛋白；37 ℃、IPTG的終濃度為1 mmol /L、220 r/min、誘導(dǎo)6 h獲得PPRV M抗原蛋白。Western blot檢測N和M蛋白均能與小反芻獸疫陽性血清特異性結(jié)合，出現(xiàn)特異性條帶，說明表達的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。本試驗為建立實驗室快速診斷PPRV 的感染、疫苗免疫后抗體水平的檢測以及基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

小反芻獸疫近年在中國周邊國家包括孟加拉國、印度、尼泊爾、巴基斯坦、哈薩克斯坦和蒙古等先后暴發(fā)大規(guī)模PPR疫情[10-12]，中國也在2007年報道西藏地區(qū)發(fā)生小反當(dāng)獸疫疫情，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失[7]，其大規(guī)模爆發(fā)的風(fēng)險明顯提高，且近期境內(nèi)罕見發(fā)生的PPR疫情[9]，農(nóng)業(yè)部也積極防控，所以當(dāng)前應(yīng)加強對PPRV的基礎(chǔ)研究，同時還應(yīng)加強對該病的流行病學(xué)監(jiān)測，建立高效、快速、可靠的病原學(xué)檢測新方法，并研發(fā)出可引起強烈的細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的疫苗，以有效控制該病在中國的流行，甚至消滅該病。國際上針對小反芻獸疫的診斷技術(shù)主要有瓊脂免疫擴散試驗(AGID)、病毒分離鑒定、膠體金試紙條、競爭ELISA、夾心EIISA、RT-PCR、中和試驗等[8]。而特異性高、操作簡便、成本低對病毒的檢測很重要。ELISA方法更加方便、快捷、可靠，適用于大量樣品的檢測診斷。N蛋白的抗原穩(wěn)定性高，而基因的保守與特異性是建立ELISA方法的關(guān)鍵，而M蛋白含有眾多B細胞線性表位。所以本試驗對GenBank發(fā)表的PPRV Nigeria 75/1株N和M基因序列進行克隆、分析及原核表達，旨在為以后建立抗體間接ELISA的快速診斷方法奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Cloning,Sequence Analysis and Prokaryotic Expression ofNandMGene of Peste des Petits Ruminants Virus Vaccine Strain

HE Yapeng,BAO Changlei,ZHANG Qi,FU Mingzhe and XU Xingang

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

According to the published sequence ofNandMgene of PPRV Nigeria 75/1 vaccine strain，two pairs of specific primers were designed and synthesized.NandMgene were amplified by RT- PCR from PPRV.NandMgene sequences were analyzed and cloned into pET-28a vector.The recombinational prokaryotic expression plasmid pET28a-Nand pET28a-Mwere successfully constructed.E.coliBL21 transformed by recombinant plasmid pET28a-Nand pET28a-Mwere induced by IPTG and detected by SDS-PACE and Western blot analysis.NandMgene were successfully cloned and expressed.SDS-PAGE analysis showed that 57.7 ku N and 38.1 ku M fusion protein were expressed by IPTG induction,respectively.Western blot analysis showed that the N and M fusion protein could combine with PPR positive serum and had well reactiongenicity.This experiment provides molecular biology characteristics of PPRV.Further more,the N and M protein can be used to prepare PPRV antibody detection kit.

PPRV;Ngene;Mgene; Clone; Sequence analysis; Prokaryotic expression

HE Yapeng,male,master student.Research area:molecular etiology and immunology.E-mail:1692831800@qq.com

XU Xingang,male,Ph.D,associate professor.Research area:molecular etiology and immunology.E-mail: 286567031@qq.com

日期：2016-12-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1005.008.html

2015-12-21

2015-12-29

陜西省科技攻關(guān)(2015NY162)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗示范站(基地)科技成果推廣(TGZX2015-32)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃(2016KTZDNY02-05)。

何亞鵬，男，碩士研究生，研究方向為分子病原學(xué)與免疫學(xué)。E-mail：1692831800@qq.com

許信剛，男，博士，副教授，研究方向為分子病原學(xué)與免疫學(xué)。E-mail：286567031@qq.com 付明哲，男，高級獸醫(yī)師，研究方向為羊病學(xué)。E-mail：1692831800@qq.com

S852.61

A

1004-1389(2017)02-0179-06

Received 2015-12-21 Returned 2015-12-29

Foundation item Shaanxi Province Science and Technology Research Project(No.2015NY162);Northwest A&F University Scientific and Technological Generalized Project of Test Station(No.TGZX2015-32)；Shaanxi Province Science and Technology Co-ordination Innovation Project(2016KTZDNY02-05).

FU Mingzhe,male,senior veterinarian.Research area:sheep disease.E-mail:1692831800@qq.com