車海彥++曹學(xué)仁++羅大全

摘 要 黃化病是一種嚴(yán)重威脅檳榔生產(chǎn)種植的毀滅性傳染性病害，目前主要在印度和我國檳榔主產(chǎn)區(qū)發(fā)生。本文從非生物與生物因素兩方面對檳榔黃化病病原認(rèn)識過程及檢測方法進(jìn)行詳細(xì)的綜述。

關(guān)鍵詞 檳榔黃化病 ；病原 ；檢測方法

中圖分類號 S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.016

Research Advances in Pathogenic Detection Technique for

Arecanut Yellow Leaf Disease

CHE Haiyan CAO Xueren LUO Daquan

（Environment and Plant Protection Institute CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory

of Integrated Pest Management on Tropical Crops / Hainan Key Laboratory for Monitoring

and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101）

Abstract Arecanut yellow leaf disease is a lethal infectious malady which seriously hampers arecanut production. It occurs mainly in arecanut plantations in India and China. The recognition and detection of the pathogen of the arecanut yellow lead disease were reviewed from the abiotic and biotic aspects.

Keywords arecanut yellow leaf disease ； pathogen ； detection methods

檳榔（Areca catechu L.）為棕櫚科多年生常綠喬木，其果實主要作為咀嚼嗜好品，并具有藥用價值。主要種植在亞洲，如印度、印度尼西亞、中國、泰國、馬來西亞、越南、緬甸、柬埔寨等國家，我國檳榔主要種植在海南和臺灣[1]，據(jù)海南省農(nóng)業(yè)廳統(tǒng)計，截止2013年，海南種植面積已達(dá)90 886 hm2，占全國的95%以上，是海南省第二大熱帶經(jīng)濟(jì)作物。

檳榔黃化?。ˋrecanut yellow leaf disease，AYLD）是一種嚴(yán)重危害檳榔生產(chǎn)種植的毀滅傳染性病害。1914年，人們首次在印度的Kerala發(fā)現(xiàn)AYLD，目前該病害僅在印度、中國和斯里蘭卡等3個國家有報道發(fā)生[2-4]。本文從非生物與生物因素兩方面對檳榔黃化病病原認(rèn)識過程及檢測方法等進(jìn)行了綜述。

1 非生物因素

檳榔黃化病在印度發(fā)生后，人們懷疑該病害可能是一種生理性病害，對檳榔葉片和土壤中的大量和微量元素、水分等進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)部分發(fā)生變化，但均不能證實上述因素是引起黃化病發(fā)生的病因[5-9]。1985年3～4月份，俞浩等通過對我國海南萬寧、屯昌等地發(fā)生黃化的檳榔園調(diào)查分析認(rèn)為，黃化病是由缺鉀引起的生理性病害，但位于屯昌的海南省藥材場部分檳榔園追施鉀肥及部分微量元素后未見癥狀減輕，到2001年時，該場檳榔黃化病發(fā)生面積已有由1981年的6.67 hm2擴展到23.3 hm2以上[10-11]。

2 生物因素

2.1 螨蟲

Khandige等[12]首次在感染黃化病的病葉中發(fā)現(xiàn)螨蟲，認(rèn)為螨蟲與黃化病發(fā)生相關(guān)。Menon等[13]研究表明由螨蟲引起的黃葉可以通過噴施對硫磷消除癥狀，證明螨蟲不是黃化病病原。

2.2 真菌

Menon[14]和Anonymous[15-16]先后從感病檳榔的不同部位分離出色二孢（Diplodia sp.）、尾孢（Cercospora）、鐮刀菌（Fusarium sp.）、木霉（Trichoderma sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）、盤多毛孢菌（Pestalotia sp.）等多個屬的真菌，但將它們回接到幼苗上均不能引起黃化病。Rawther[17]發(fā)現(xiàn)感病的植株根部大多腐爛，推測該病害由真菌引起。此后研究發(fā)現(xiàn)，根腐與黃化病沒有關(guān)系，健康與感病葉片上的真菌種類也未見顯著差異，說明黃化病與真菌無關(guān)[18-19]。

2.3 細(xì)菌

1962～1964年，印度科研人員從病樹的根部分離到Bacillus，Xanthomonas和Serratia細(xì)菌，但接種檳榔苗上，未表現(xiàn)黃化病癥狀[20-21]。Srivastava等[22]觀察到感病檳榔根部存在細(xì)菌菌流，認(rèn)為與黃化病相關(guān)，并從中分離出2個菌株，其中1個被鑒定為假單孢菌。人們對檳榔園中的細(xì)菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，感病的檳榔園中細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)多于健康的檳榔園，來自印度Palode地區(qū)大約70%感病的檳榔樣品根部發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌流，來自Mohitnagar地區(qū)的大約20%健康樣品根部發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌流，但是來源于Vittal地區(qū)的健康樣品根部沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌流[23-24]。盡管人們對細(xì)菌與黃化病發(fā)生的關(guān)系做了大量研究，但未見關(guān)于用柯赫氏法則驗證細(xì)菌與黃化病發(fā)生關(guān)系的文獻(xiàn)報道。

2.4 線蟲

Nair[25]在印度Kerala地區(qū)感染黃化病的檳榔根區(qū)發(fā)現(xiàn)爪哇根結(jié)線蟲（Meloidogyne javanica），螺旋屬線蟲（Helicotylenchus）和矮化屬線蟲（Tylenchorhynchus），首次提出線蟲與黃化病的關(guān)系。隨后科研人員從健康和感病檳榔園中分離到螺旋屬線蟲（Helicotylenchus）、真滑刃線蟲屬（Aphelenchus）等多個屬的線蟲[26-28]。1974年到1979年間，印度的Central Plantation Crops Research Institute對Kerala，Karnataka和Tamil Nadu地區(qū)的檳榔園中的線蟲種類和數(shù)量等做了大量的調(diào)查研究工作，從435份土壤樣品和822份根部樣品中分離到28個屬的植物寄生線蟲，其中腎線蟲（Rotylenchulus reniformis）、香蕉穿孔線蟲（Radopholus simillis）、雙宮螺旋線蟲（Helicotylenchus dihystera）、芒果擬鞘線蟲（Hemicriconemoides mangiferae）、塞氏紐帶線蟲（Hoplolaimus seinhorsti）在土壤樣品中數(shù)量最多。香蕉穿孔線蟲（Radopholus simillis）在根部樣品中數(shù)量最多，病根每克根最多產(chǎn)生440個線蟲，而健康根每克最多產(chǎn)生48個線蟲[29-31]。Sundararaju[32]用殺線蟲劑處理檳榔園后，黃化病的發(fā)生率降低，產(chǎn)量提高。Koshy等[33]將感病檳榔根部分離的香蕉穿孔線蟲接種到健康檳榔苗上，經(jīng)過2年觀察發(fā)現(xiàn)，與對照相比，接種的幼苗葉片變?yōu)槌壬?，根部壞死，植株長勢差、高度低、樹冠變小，葉片數(shù)量少。再將從感病幼苗根部分離的香蕉穿孔線蟲回接到健康檳榔樹上，經(jīng)過3年的觀察發(fā)現(xiàn)，與對照相比，接種樹的根變短、根重變低、葉片數(shù)量變少、樹冠變小等。 接種幼苗和大樹雖然表現(xiàn)感病癥狀，但未出現(xiàn)檳榔黃化病的田間典型表現(xiàn)癥狀。

2.5 病毒

Menon[34-36]通過紙層析的方法在感病葉片汁液中發(fā)現(xiàn)具有活性的核蛋白，將免疫獲得的兔血清與感病檳榔葉片粗提純液進(jìn)行免疫反應(yīng)，有沉淀產(chǎn)生，該病害能通過汁液或土壤傳播到檳榔和指示植物豇豆（Vigna unguiculata）、洋刀豆（Canavalia ensiformis D C.）等上，推測病毒或類病毒可能是引起該病害的病原。Nayar[37]通過組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，檳榔感病后組織學(xué)上發(fā)生的變化與病毒侵染后引起的變化相似。

2.6 植原體

2.6.1 植原體病原認(rèn)識過程

植原體（Phytoplasma）原稱類菌原體（Mycoplasma-like organisms， MLOs），無細(xì)胞壁，由生物膜包圍，隸屬于細(xì)菌界（Bacteria）。1971年，Nayar[38]從感病檳榔植物葉組織培養(yǎng)到疑似植原體的生物，首次提出植原體與黃化病相關(guān)。1978年，Nayar 和 Seliskar[39]通過電子顯微鏡首次在感病檳榔的篩管組織中發(fā)現(xiàn)植原體。隨后其他研究者也在感病檳榔植株多個器官的篩管組織中觀察到植原體，含量由高到低依次為頂端分生組織、根尖、葉軸、葉柄、心葉，成熟的老葉中含量較低[40-42]。利用Dienes和DAPI等染色劑，通過光學(xué)顯微鏡觀察，也進(jìn)一步證實了感病植株篩管組織中存在植原體[43]。Nair & Daniel[44]發(fā)現(xiàn)感病的檳榔園中存在與植原體病害傳播相關(guān)的甘蔗斑袖蠟蟬（Proutista moesta）。Ponnamma等[45-47]將田間捕獲的甘蔗斑袖蠟蟬在感病植株上獲毒飼育后，再將其投放到健康植株上，在甘蔗斑袖蠟蟬的唾液腺中觀察到植原體。從1987年5月到1990年10月，通過持續(xù)的實驗研究，發(fā)現(xiàn)6株經(jīng)樹蟬傳毒的檳榔均表現(xiàn)葉片黃化癥狀，其中在5株中觀察到植原體存在，空白對照樣品中均未發(fā)現(xiàn)植原體。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用巢式或半巢式PCR技術(shù)，Manimekalai[48-49]從印度的Karnataka的Sullia地區(qū)采集發(fā)病樣品，提取了感病植株花序、根部和葉片樣品的DNA，克隆了16S rDNA和 secA 基因，通過序列分析確定印度檳榔黃化植原體病原歸屬于‘Candidatus Phytoplasma oryzae-related strain（16SrXI組）。Muddumadiah等[50]也從上述地區(qū)采集樣品，擴增得到的 16S rDNA序列，經(jīng)克隆測序分析發(fā)現(xiàn)該植原體屬于‘Candidatus Phytoplasma asteris （16SrI組）。

我國自1981年在海南屯昌首次發(fā)現(xiàn)黃化病以來，科研人員對病原開展了一系列的研究工作。金開璇等[11]通過電鏡觀察，在檳榔黃化病病株中發(fā)現(xiàn)類細(xì)菌和類菌原體。羅大全等[51-53]通過電鏡在感病檳榔篩管組織中觀察到植原體，未發(fā)現(xiàn)類細(xì)菌，經(jīng)四環(huán)素注射可以抑制病情發(fā)展，這與植原體對四環(huán)素族抗菌素反應(yīng)是一致的，利用植原體通用引物對，在表現(xiàn)黃化癥狀的樣品中通過PCR技術(shù)擴增到植原體特異條帶，進(jìn)一步證實植原體是引起黃化病的病原，但是用椰子致死性黃化病病原特異性擴增引物對在檳榔黃化樣品中擴增不到特異片段。車海彥等[54]通過對采集自屯昌、瓊海、定安、萬寧、三亞等5個市縣的15個感病植株的花苞進(jìn)行PCR檢測，在15個樣品的花苞DNA中均擴增到植原體16S rDNA，通過分析確定該植原體病原屬于16SrI-G亞組組。周亞奎等[55]采集海南3個市縣28個感病樣品，在9個葉片樣品中檢測到植原體，經(jīng)PCR檢測克隆測序分析，該植原體屬于16SrI-B亞組。未有研究證實海南檳榔黃化病樣品中存在上述兩種植原體的復(fù)合侵染。楊文君等[56]克隆了海南瓊海的檳榔黃化植原體膜蛋白基因（AcPmp）編碼區(qū)，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并制備了效價高、特異性強的抗血清。唐慶華等[57]在對海南檳榔園中傳毒昆蟲調(diào)查中發(fā)現(xiàn)印度報道的甘蔗斑袖蠟蟬，該蟲在檳榔園中屬常見昆蟲，但未確定其是否為海南檳榔黃化病的傳毒昆蟲。劉慧娟[58]利用RAPD擴增體系，將海南檳榔分為兩種類型。兩種類型均有非病區(qū)樣品分布，但是兩種類型中的檳榔群體，在發(fā)病時間和發(fā)病程度上存在一定的差異。第一類型檳榔群體發(fā)病較重、較早；第二類型中非病區(qū)檳榔群體較多?？蒲腥藛T還對檳榔樹感染黃化病后，體內(nèi)發(fā)生的變化進(jìn)行了研究，檳榔感病后，Cu含量升高，葉片中Ca、Mg 、Zn、B、Mo、Fe、Mn含量降低[59-60]，植株中相關(guān)酶活性、蛋白含量、激素含量等也發(fā)生了變化[61]。植株中核酮糖1，5-二磷酸羧化/加氧酶和蕈狀支原體高同源蛋白，可能參與了檳榔黃化病發(fā)生和發(fā)展過程[62]。

2012年，人們在斯里蘭卡南部的檳榔樹上發(fā)現(xiàn)黃化病，Kanatiwela-de Silva等在斯里蘭卡的馬特勒（Matara）地區(qū)采集疑似感染黃化病的檳榔葉片樣品，通過掃描電子顯微鏡，在感病檳榔葉片篩管組織的內(nèi)表面觀察到直徑在100～1 000 nm的植原體，進(jìn)一步通過巢式PCR擴增植原體secA基因，經(jīng)克隆測序分析發(fā)現(xiàn)該植原體屬于16SrXIV組[4]。

2.6.2 植原體病原檢測技術(shù)

檳榔黃化病田間主要根據(jù)其癥狀表現(xiàn)進(jìn)行識別：發(fā)病初期，植株下部倒數(shù)第2～4張羽狀葉片外緣1/4處開始出現(xiàn)黃化，然后逐漸向葉中擴展，黃化部分與綠色部分有明顯的分界，新抽生的葉片短小，無法正常舒展長大，節(jié)間變短，抽生的花穗短小。

隨著科技水平的提高，人們開始使用血清學(xué)方法對檳榔黃化植原體病原進(jìn)行檢測，2011年，Rajeev等[63]將從感病檳榔中純化的植原體，免疫兔子，獲得多克隆抗體，經(jīng)瓊脂雙擴散和抗原直接包被法檢測證明，制備的抗體可以區(qū)分健康和感病植株。

常規(guī)PCR經(jīng)常檢測不到檳榔黃化植原體病原，科研工作者大多使用巢式、半巢式和實時熒光PCR對病原進(jìn)行檢測，車海彥等[54]、周亞奎等[55]利用植原體通用引物R16mF2/R16mR1和 R16F2/R16R2對海南檳榔黃化植原體病原進(jìn)行檢測，擴增到大小約1 200 bp的特異條帶。Manimekalai等[49-50]利用植原體通用引物P1/P7-R16F2n/R16R2、根據(jù)椰子根萎蔫植原體設(shè)計的引物1F7/7R3-1F7/7R2和4Fwd/3Rev-4Fwd/5Rev對印度檳榔黃化植原體病原進(jìn)行檢測，分別擴增到大小約為1 200 bp、500 bp和1 100 bp的特異條帶。Kanatiwela-de Silva等[4]利用引物SecAfor1/SecArev3（植原體通用引物）和RicesecAfor2/RiceseAcrev3（植原體16SrXI與16SrXIV組特異引物），對斯里蘭卡檳榔黃化植原體病原進(jìn)行巢式PCR檢測，擴增到大小為420 bp的特異條帶。車海彥等[64]基于海南檳榔黃化植原體（16SrI組）16S rRNA基因設(shè)計1對特異性引物和TaqMan-MGB探針組合，建立了海南檳榔黃化植原體的實時熒光PCR快速檢測方法。Nair等[65-66]基于印度檳榔黃化植原體（16SrXI組）16S rRNA基因建立起適合檢測檳榔黃化植原體的SYBR green法建立實時熒光PCR檢測體系和LAMP技術(shù)體系。上述方法簡單、快速，適合病害的田間快速診斷、種苗繁育過程中進(jìn)行快速檢測。

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① 基金項目：農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（No.2014GB2E200114）；海南省重大科技計劃項目（No.ZDZX2013019）。

收稿日期：2016-09-18；責(zé)任編輯/鄭淑娟；編輯部E-mail： rdnk@163.com。

② 車海彥（1976～），女，博士，副研究員，研究方向為植物病毒與植原體病害，E-mail：chehaiyan2012@126.com

③ 通訊作者：羅大全（1968～），男，研究員，研究方向為植物保護(hù)，E-mail：luodaquan@163.com。