王玲 劉輝國

摘要：目的 觀察金雀異黃素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)人肺泡上皮細胞A549發(fā)生炎癥與凋亡的影響，探討其改善肺損傷的作用機制。方法 CCK-8法檢測不同濃度金雀異黃素和/或LPS干預(yù)細胞12 h后的活力；RT-PCR檢測金雀異黃素對LPS誘導(dǎo)的炎性因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達；TUNEL法檢測細胞凋亡；Western blot檢測信號通路的變化。結(jié)果 金雀異黃素（1、5、10 μmol/L）對細胞活力無明顯影響，LPS（1 μg/mL）可顯著降低細胞活力，而金雀異黃素與LPS共同干預(yù)則細胞活力呈濃度依賴性升高；RT-PCR結(jié)果顯示，LPS可顯著提高炎性因子的基因表達，而金雀異黃素則可呈濃度依賴和時間依賴抑制其表達；TUNEL染色結(jié)果顯示，金雀異黃素（10 μmol/L）與LPS聯(lián)合干預(yù)12 h可顯著減少LPS誘導(dǎo)的細胞凋亡；Western blot結(jié)果顯示，金雀異黃素（10 μmol/L）與LPS（1 μg/mL）協(xié)同刺激A549細胞30 min可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα、p65信號通路的磷酸化水平。結(jié)論 金雀異黃素可抑制LPS誘導(dǎo)的人肺泡上皮細胞發(fā)生炎癥和凋亡，從而發(fā)揮保護作用。

關(guān)鍵詞：金雀異黃素；急性肺損傷；A549細胞；炎癥；細胞凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.014

中圖分類號：R285.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）03-0057-04

Effects of Genistein on Inflammation and Apoptosis of Human Alveolar Epithelial Cell A549 Induced by Lipopolysaccharide WANG Ling1， LIU Hui-guo2 （1. The Hospital of Wuhan University， Wuhan 430071， China； 2. Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of HUST， Wuhan 430030， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Genistein （GEN） acting on human lung adenocarcinoma A549 cells induced by LPS； To discuss its action of mechanism for improving injuries of lung. Methods The activity of cell treated with different concentrations of Genistein was detected by CCK-8 method and / or LPS intervention for 12 h. The expressions of inflammatory cytokines IL-1β， IL-6， and TNF-α induced by LPS were detected by RT-PCR. TUNEL was used to detect apoptosis， and Western blot was used to detect the changes of signal pathway. Results GEN （1， 5， 10 μmol/L） alone had no effects on cell activity； LPS （1 μg/mL） reduced cell viability significantly， while co-treated the A549 cells with GEN and LPS could reverse this condition in a concentration-dependent manner； RT-PCR results showed that LPS could significantly increase the level of gene expression of inflammatory factors， while GEN could inhibited this phenomenon in both concentration-and time-dependent manner； the results of TUNEL staining showed that GEN （10 μmol/L） combined with LPS for 12 h could significantly decrease the apoptosis rate； the results of Western blot showed that GEN possibly inhibited the inflammation and apoptosis through inhibiting the phosphorylation of IκBα， p65 signaling pathways. Conclusion GEN has anti-inflammation and anti-apoptosis effects on A549 cells induced by LPS， so as to play a protective rate.

Key words： Genistein； acute lung injury； A549； inflammation； apoptosis

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的死亡率較高，其主要特點為中性粒細胞的聚集、間質(zhì)水腫、肺泡上皮細胞完整性破壞及大量炎性因子的產(chǎn)生[1]。雖然近些年來對ALI的發(fā)病機制研究已經(jīng)有了長足進步，但目前的治療并未降低ALI患者死亡率及增加幸存者生活質(zhì)量[2]。脂多糖（LPS）為革蘭陰性細菌細胞壁的組成成分，可誘導(dǎo)炎性反應(yīng)繼而導(dǎo)致免疫功能障礙[3]。LPS氣管內(nèi)給藥可造成嚴重肺損傷模型，近年來已經(jīng)成為共識[4]。因此，我們采用LPS體外干預(yù)肺泡上皮細胞模擬肺損傷模型。核因子-κB（NF-κB）在調(diào)控炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。多項研究表明，NF-κB信號通路在肺部損傷疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其誘導(dǎo)的細胞因子如白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在ALI的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。

金雀異黃素（genistein，GEN）是一種存在于豆科植物和齒狀植物中的天然異黃酮化合物，研究表明，其具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用[7-8]，但其是否影響ALI中肺泡上皮細胞的炎性反應(yīng)尚未見報道。本實驗觀察GEN對肺泡Ⅱ型上皮細胞在LPS誘導(dǎo)下發(fā)生上皮損傷的影響，探討其改善ALI的作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物及制備

GEN，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，貨號446-72-0，純度>98%。取2.7 mgGEN溶于1 mL二甲基亞砜（DMSO）中配制實驗所用的母液。

1.2 細胞

A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞株，中國科學(xué)院上海細胞庫，細胞培養(yǎng)和干預(yù)刺激均在獨立的細胞房中進行，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長達次融合狀態(tài)時0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)實驗需要接種于不同的培養(yǎng)皿中。分組誘導(dǎo)前以無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，以減少血清對刺激因素的影響。

1.3 主要試劑與儀器

高糖DMEM basic（1×）培養(yǎng)基、新生小牛血清（New born serum，NBS）、胰酶，Gibco公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；LPS，Sigma公司；RT-PCR試劑盒，Roche公司；p-IκBα、p-p65、IκBα、p65、GAPDH（Rabbit IgG），Cell Signaling Technology公司。多功能微孔板檢測系統(tǒng)Synergy HT（美國BioTek公司），紫外分光光度計NANODROP 2000c（Thermo scientific），實時定量PCR儀Light Lycler 480（Roche公司），RT反轉(zhuǎn)錄儀Veriti 96 well Thermal Lycler（Applied Biosystems公司），倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS），恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞處理和分組

待A549細胞貼壁生長密度達80%時，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，加入饑餓液，置于溫箱8 h后置換為含有LPS（1 μg/mL）的饑餓液，重新置于溫箱中培養(yǎng)，收取蛋白質(zhì)和RNA樣本。實驗分為對照組、LPS組、LPS+GEN 1 μmol/L組、LPS+GEN 5 μmol/L組、LPS+GEN 10 μmol/L組和GEN 10 μmol/L組。

2.2 CCK-8法檢測細胞活力

細胞被接種至96孔板，每孔100 μL，密度大約為2×105個/mL，置于溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓24 h，采用不同處理因素干預(yù)72 h后，將96孔板中培養(yǎng)基換為含10 μL CCK-8的無血清培養(yǎng)基100 μL，溫箱中孵育2～2.5 h后于酶標(biāo)儀波長450 nm處進行測定。

2.3 Western blot檢測信號通路磷酸化水平

冰上裂解細胞10 min，置于1.5 mL離心管中，超聲裂解儀5 kHz裂解10～15 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液移至離心管中，BCA定量檢測蛋白濃度并將蛋白濃度調(diào)整一致后置于煮沸儀上將其變性。每組樣本混勻后取10 μL行10%SDS-PAGE凝膠電泳，檢測內(nèi)參指標(biāo)GAPDH，根據(jù)各樣本的光密度值調(diào)整上樣劑量，使其與GAPDH的光密度值保持一致，后每組以校正后的上樣劑量進行凝膠電泳，將蛋白以100 V、90 min移至PVDF膜上，用一抗封閉液封閉12 h，一抗包括p-IκBα、p-p65、IκBα、p65，再用TBST洗3次，將其放入對應(yīng)的加有二抗的稀釋液中避光孵育1 h，二抗為Alexa Fluor? 488 goat anti-Rabbit IgG，再用TBST洗3次，放入熒光檢測儀中，檢測目的條帶，應(yīng)用Odyssey圖像分析軟件檢測各組蛋白的光密度值，作為蛋白表達水平。

2.4 RT-PCR檢測炎性因子基因表達

細胞以不同因素處理后，棄去培養(yǎng)基，以Trizol法提取細胞總RNA，采用紫外分光光度法測定其含量與純度。根據(jù)樣本所測濃度，取適當(dāng)劑量，將各樣本濃度調(diào)整一致后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照，采用20 μL體系進行PCR擴增。反應(yīng)條件為：94 ℃、2 min，1個循環(huán)，94 ℃、40 s，25～35個循環(huán)，50～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，1個循環(huán)。引物序列見表1。

2.5 TUNEL染色檢測細胞凋亡

將細胞接種至爬片上，調(diào)整密度為1×105個/mL，饑餓18 h，加入不同干預(yù)因素處理細胞12 h，PBS洗3次，1%多聚甲醛固定10 min，再用乙醇/乙酸2∶1混合液-20 ℃固定5 min，PBS清洗3 min。加入平衡液室溫孵育10 s后滴加TdT酶工作液，37 ℃孵育1 h。加入工作液，振蕩15 s后孵育10 min，PBS洗3次，吸干液體，滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液，避光孵育30 min，PBS再洗3次，DAPI封片，鏡下觀察拍照。正常細胞核被染為藍色，凋亡細胞核被染為綠色，每組隨機選擇8個視野，計算細胞凋亡率（凋亡細胞數(shù)÷細胞總數(shù)×100%），取其平均值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩均數(shù)比較采用SNK法（方差齊）或Dunnett's T3（方差不齊）檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 金雀異黃素對A549細胞活力的影響

與對照組比較，GEN（1、5、10 μmol/L）單獨干預(yù)A549細胞對其活力無影響；GEN（1、5、10 μmol/L）與LPS同時干預(yù)A549細胞則細胞活力明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.2 金雀異黃素對脂多糖誘導(dǎo)A549細胞炎性因子的影響

與對照組比較，LPS（1 μg/mL）處理12 h后A549細胞炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α基因表達顯著增加（P<0.01）；GEN（1、5、10 μmol/L）與LPS同時干預(yù)炎性因子基因表達較LPS組顯著降低（P<0.05，P<0.01），且呈濃度依賴性；GEN（10 μmol/L）單獨干預(yù)A549細胞則對炎性因子的基因表達無影響。結(jié)果見表3。

注：與對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01

與對照組比較，LPS干預(yù)3、6、12 h后A549細胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因表達明顯升高（P<0.01）；GEN（10 μmol/L）與LPS同時干預(yù)炎性因子mRNA表達較LPS組顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表4。

4.3 金雀異黃素對脂多糖誘導(dǎo)A549細胞凋亡的影響

與對照組比較，LPS（1 μg/mL）干預(yù)細胞12 h后凋亡率為42.3%，GEN（10 μmol/L）與LPS同時干預(yù)A549細胞后凋亡率降為13.6%，GEN（10 μmol/L）單獨干預(yù)A549細胞對細胞凋亡無影響。結(jié)果見圖1。

4.4 金雀異黃素對脂多糖誘導(dǎo)A549細胞IκBα、p65信號通路磷酸化水平的影響

GEN（10 μmol/L）與LPS（1 μg/mL）協(xié)同刺激A549細胞30 min可顯著抑制LPS誘導(dǎo)IκBα、p65信號通路的磷酸化水平（P<0.01），GEN（10 μmol/L）單獨干預(yù)A549細胞對以上信號通路則無影響。結(jié)果見圖2、表5。

1

5 討論

本研究結(jié)果顯示：LPS連續(xù)刺激A549細胞12 h可誘導(dǎo)其產(chǎn)生大量炎性因子且細胞凋亡率上升；RT-PCR結(jié)果提示，GEN可呈濃度依賴性及時間依賴性逆轉(zhuǎn)炎性因子的上調(diào)；TUNEL染色結(jié)果提示，其亦可降低細胞凋亡率。Western blot檢測結(jié)果顯示，GEN可能是通過抑制NF-κB信號通路中的IκBα及p65的磷酸化而發(fā)揮保護作用。

有研究顯示，GEN在急性和慢性炎癥中均可發(fā)揮顯著調(diào)控作用，作用靶點是通過抑制NF-κB及STAT信號通路的活化[9]。馮贊杰等[10]研究顯示，GEN可抑制人血管平滑肌細胞中NF-κB的激活從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用，其亦可抑制大鼠關(guān)節(jié)炎滑膜細胞中IL-1β、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生。本實驗選擇GEN對ALI的體外細胞模型進行干預(yù)，通過預(yù)實驗結(jié)果選擇了3個藥物濃度（1、5、10 μmol/L）來進行實驗。

天然免疫在機體預(yù)防病原體侵襲發(fā)揮首當(dāng)其沖的作用，LPS與之細胞膜上對應(yīng)的Toll樣受體相結(jié)合后可觸發(fā)天然免疫反應(yīng)，NF-κB信號通路的活化需要κB（IκBα和IκBβ）的磷酸化與降解。NF-κB主要由2個亞基（p65和p50）組成。IκBα與p65在細胞質(zhì)中相結(jié)合，抑制NF-κB的細胞核轉(zhuǎn)位，一旦NF-κB入核，其可調(diào)控細胞核轉(zhuǎn)錄細胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α及COX-2等。此外，LPS可增加細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，增加線粒體膜電位的通透性，繼而誘發(fā)內(nèi)源性凋亡通路Caspase9的激活，細胞本身產(chǎn)生的TNF-α亦可作用于細胞膜，誘導(dǎo)外源性凋亡通路Caspase8的活化，2組凋亡通路均可通過Caspase3的活化而誘導(dǎo)細胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示，GEN可顯著抑制IκBα及p65的磷酸化水平，抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，其下游的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平均被GEN所抑制，TUNEL染色提示LPS誘導(dǎo)的細胞凋亡也明顯減少。因此，我們認為GEN可能通過抑制IκBα及p65的磷酸化從而發(fā)揮抗細胞炎癥及凋亡的作用。

綜上，GEN可抑制LPS誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細胞發(fā)生炎癥與凋亡，為下一步動物在體研究提供了一定基礎(chǔ)，但本研究對信號通路的具體機制闡述尚不明確，對線粒體膜電位及活性氧的產(chǎn)生亦未能明確，有待進一步實驗，以明確GEN的具體作用機制。

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（收稿日期：2016-04-21）

（修回日期：2016-05-18；編輯：華強）