朱明駿，尹 雋，鐘 江

(復旦大學 生命科學學院 微生物學與微生物工程系 上海 200438)

桿狀病毒(Baculovirus)是一類在自然界中僅感染節(jié)肢動物的病毒，在分類上屬于桿狀病毒科，基因組為90～160kb的雙鏈環(huán)狀DNA[1]．已報道的桿狀病毒有500多種，其中苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是桿狀病毒的模式種，其基因組大小為133894bp，包含154個潛在的開放閱讀框(ORF)[2]．

AcMNPVp95基因由第83號開放閱讀框編碼，又稱為ac83．它編碼一個含847個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[2-3]．研究表明該蛋白是病毒核衣殼的組成蛋白[4-5]，同時也是病毒經(jīng)口感染因子(Per os Infectivity Factor, PIF)復合體的組成部分，與病毒經(jīng)口感染昆蟲有關[6-7]．P95蛋白有一個幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構域，刪除該結(jié)構域后，病毒無法經(jīng)幼蟲中腸感染，但可以經(jīng)血腔注射感染[7]．

本實驗室早期的研究結(jié)果表明，雖然p95基因破壞后病毒無法在Sf9細胞中復制，但編碼P95蛋白N端序列的1kb基因序列對于病毒的復制是非必需的[8]．Zhu等[7]研究表明，在p95基因敲除的病毒基因組中回補451～600位氨基酸殘基對應的450bp基因序列后，就能部分恢復病毒在Sf9細胞中復制和產(chǎn)生子代病毒的能力，但其效價仍僅100 TCID50/mL左右，大大低于正常情況．

本研究構建了2株不能表達p95基因但帶有對應P95蛋白565～677位氨基酸的一段339bp核心序列的重組病毒，證實重組病毒可以在Sf9細胞中完成復制，且重組病毒復制水平接近野生型病毒．這項研究進一步明確了p95基因核心區(qū)域的位置，并為研究其作用機制提供了基礎．

1 材料與方法

1.1 細菌、細胞和病毒

大腸桿菌EscherichiacoliTG1，DH10B等菌株，Spodopterafrugiperda細胞系Sf9由本實驗室保存．Sf9細胞用TNM-FH培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich, MO, USA)補充10%的小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素在27℃培養(yǎng)．表達增強型綠色熒光蛋白基因egfp的重組病毒AcEGFP由本實驗室保存，用來代表的能夠完全復制的野生型病毒．

1.2 質(zhì)粒的構建

注： 加下劃線部分為AvrⅡ酶切位點．

根據(jù)實驗室研究結(jié)果，選取p95基因核心區(qū)域的DNA序列(339bp，AcMNPV基因組位置： 69576～69914bp，以下稱為Core339)，用339upper/339lower引物對(表1)進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物T載體克隆后，經(jīng)序列分析驗證，獲得兩端帶有AvrⅡ識別位點的p95基因核心片段Core339．將在pFastbac1質(zhì)粒的多克隆位點插入egfp基因的質(zhì)粒pBG[9]用AvrⅡ酶切，并連接到用AvrⅡ酶切的Core339上，得到Core339片段以正、反兩種方向分別插入pFastbac1 SV40 polyA信號序列后的兩種重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastbacEGFP/Core339+和pFastbacEGFP/Core339-．質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切檢驗正確．另將ie1啟動子帶動的egfp片段插入pFastbac1質(zhì)粒多克隆位點的HindⅢ處，得到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastbac-ie1EGFP．

1.3 重組Bacmid的構建

首先利用λ-red系統(tǒng)[10]以阿普拉霉素抗性基因(apra)置換p95基因的大部分區(qū)域，敲除p95基因．p95基因位于基因組67884～70427bp處，本實驗中敲除的區(qū)域為68001～70427bp，僅保留了p95從起始密碼子起的117bp．根據(jù)生物信息學分析，該區(qū)域可能是位于p95基因上游(反向)的AcTLP基因的啟動子[11]．通過PCR擴增apra基因，使得到的擴增產(chǎn)物在兩端分別帶有39bp和57bp與敲除區(qū)域兩側(cè)分別同源的序列．將表達λ-red重組酶的pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Bac-to-Bac菌株DH10Bac，得到DH10Bac/pKD46，再轉(zhuǎn)入上述帶有同源序列的apra基因PCR產(chǎn)物，篩選對阿普拉霉素(40μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)同時具有抗性的重組菌．用試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取Bacmid DNA，PCR檢驗確認p95基因已經(jīng)被敲除．將Bacmid DNA通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入E.coliDH10B，隨后轉(zhuǎn)入帶有Tn7轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pMON7124，得到E.coliDH10Bac-bP95K/helper.

按照Bac-to-Bac技術手冊(Invitrogen)，用以上構建的3種轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac-bP95K/helper，篩選得到相應的重組Bacmid bP95K/Core339/EGFP+，bP95K/Core339/EGFP-和bP95K/EGFP．通過PCR擴增對這些Bacmid進行驗證．

1.4 重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細胞

Sf9細胞接入24孔細胞培養(yǎng)板，2×105/孔．培養(yǎng)過夜后，用重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染．細胞轉(zhuǎn)染利用Cellfectin Ⅱ(Invitrogen)按產(chǎn)品說明書進行．在轉(zhuǎn)染后一定時間用熒光顯微鏡(Olympus CKX41)觀察感染情況．轉(zhuǎn)染后一定時間懸浮細胞，離心后收獲上清，用終點稀釋法測定重組病毒效價．

1.5 重組病毒感染Sf9細胞

Sf9細胞接入24孔細胞培養(yǎng)板，2×105/孔．培養(yǎng)過夜后，用一定量重組病毒感染，使MOI約為5pfu/cell．感染后一定時間懸浮細胞，離心后收獲上清，用終點稀釋法測定重組病毒效價．

1.6 感染細胞中病毒DNA拷貝數(shù)的測定

Sf9細胞用重組病毒感染(MOI=5 pfu/cell)，感染后不同時間收集細胞，用PBS離心清洗(3000r/min，5min)后，細胞沉淀加入20μL水，80μL 0.4% SDS(TE配置)，5μL 20mg/mL的蛋白酶K(Roche)，1μL RNase(1000×).50℃消化5～8h．酚/氯仿/異戊醇抽提2～3次后，用無水乙醇沉淀總DNA．DNA拷貝數(shù)測定使用SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)定量PCR預混液(TaKaRa)進行，引物為gp64upper/gp64lower(表1)．Real-time PCR使用Stratagene Mx 3000p進行，Ct值用以2-ΔΔt法進行相對定量，以同一樣本2h時為1．

1.7 SDS-PAGE電泳和Western blot檢測P95蛋白表達

轉(zhuǎn)染后72h收獲細胞，3000r/min離心5min．細胞沉淀用PBS離心清洗后，加入50μL樣品緩沖液，100℃煮沸5min．樣品進行12% SDS-PAGE電泳和電轉(zhuǎn)移．用Western blot檢測P95蛋白的表達，一抗用鼠源P95多克隆抗體(實驗室自制)，二抗為AP偶聯(lián)抗鼠IgG抗體(Sigma-Aldrich)，用BCIP/NBT顯色．

2 結(jié)果

2.1 重組Bacmid的構建

根據(jù)前期研究結(jié)果[7-8]和實驗室初步數(shù)據(jù)(尹雋等，未發(fā)表)，將p95基因中一段339bp的序列(Core339，位于AcMNPV基因組69576～69914，對應P95蛋白565～677位氨基酸)以正反兩個不同的方向插入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastbacEGFP報告基因egfp編碼區(qū)及多聚腺苷信號(SV40 PA)下游，得到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastbacEGFP/Core339+和pFastbac/Core339-．這兩個質(zhì)粒中egfp基因位于多角體啟動子下方，所插入的Core339上下游沒有明顯的啟動子．另外將ie1啟動子驅(qū)動egfp基因的片段插入pFastbac1多克隆位點，得到pFastbac-ie1EGFP．

通過λ-red方法用阿普拉霉素抗性基因(apra)置換病毒基因組Bacmid中p95基因的絕大部分序列，得到p95基因缺失且多角體位點空白，可以轉(zhuǎn)入其他基因的Bacmid bP95K．將上述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)入帶有bP95K和Tn7轉(zhuǎn)座酶表達質(zhì)粒的大腸桿菌，通過Bac-to-Bac獲得重組Bacmid bP95K/EGFP/339+，bP95K/EGFP/339-，和bP95K/EGFP．它們在p95基因位點和多角體基因位點的結(jié)構如圖1(a)所示．

圖1 重組Bacmid p95基因位點和多角體基因位點結(jié)構示意圖(a)及構建結(jié)果的PCR擴增驗證(b)Fig.1 The diagram of recombinant Bacmid in p95 and polyhedrin locus (a) and the verification of construction results by PCR method(b)

通過PCR擴增驗證重組Bacmid的正確性，結(jié)果如圖1(b)所示．用p95基因上下游引物(p95upper/p95lower，表1)進行PCR擴增，作為對照的p95野生型Bacmid bAcEGFP的擴增得到2.5kb片段，而p95基因缺失的3個重組Bacmid中都只能擴增得到1.5kb的片段．用Core339上下游引物(339upper/339lower，表1)進行PCR擴增，除了bP95K/EGFP未得到擴增產(chǎn)物外，其余3種Bacmid均得到339bp的片段．用BacmidF引物與339upper進行PCR擴增，僅bP95K/EGFP/339-有3.1kb的擴增產(chǎn)物，而用BacmidF引物與339lower進行PCR擴增，僅bP95K/EGFP/339+有3.1kb的擴增產(chǎn)物．以上結(jié)果均與預期一致，表明3種Bacmid構建正確．

2.2 帶有Core339的重組病毒的獲得

用Bacmid bP95K/EGFP、bP95K/EGFP/339+、bP95K/EGFP/339-轉(zhuǎn)染Sf9細胞，120h后在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示．其中bP95K/EGFP/339+、bP95K/EGFP/339-轉(zhuǎn)染的細胞中已有明顯的感染擴散現(xiàn)象，表明病毒復制已經(jīng)啟動，而bP95K/EGFP僅個別細胞可以觀察到熒光．取轉(zhuǎn)染上清測定病毒效價，bP95K/EGFP效價低于100 TCID50/mL，雖經(jīng)病毒傳代培養(yǎng)，未能得到有感染力的病毒，與以前的報道一致[7]．bP95K/EGFP/339+、bP95K/EGFP/339-轉(zhuǎn)染上清液中的病毒效價均達到1.0×104TCID50/mL左右，傳代培養(yǎng)后效價進一步提高，由此得到了重組病毒vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-．為確保重組病毒確實為僅帶有Core339的p95基因缺陷型，從感染細胞上清中提取了病毒DNA，進行PCR擴增驗證，得到肯定的結(jié)果(未顯示)．

圖2 帶有p95基因Core339片段的重組桿狀病毒感染Sf9細胞120h后的熒光顯微鏡圖Fig.2 The fluorescence microscopy pictures of Sf9 cells infected with recombinant baculovirus containing Core339 fragment of p95 gene(120hpi)

圖3 重組病毒感染的Sf9細胞中P95蛋白的Western blot 檢測Fig.3 Western blot analysis of P95 expression in Sf9 cells infected with recombinant virus

進一步檢測的重組病毒感染細胞中P95蛋白的表達情況，結(jié)果如圖3所示．可見僅有p95野生型的對照有完整的P95蛋白表達，vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-感染的細胞中均未檢測到條帶，這也證明得到重組病毒的p95基因已經(jīng)被敲除而無法表達．

2.3 帶有Core339片段的重組桿狀病毒的復制動態(tài)

用vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-感染Sf9細胞(MOI=5 pfu/cell)，在感染后不同時間測定培養(yǎng)中病毒的效價，以p95基因為野生型的AcEGFP病毒作為對照，結(jié)果如圖4所示．由圖可見，帶有Core339片段的重組病毒產(chǎn)生出芽型病毒的時間明顯晚于AcEGFP，但120h后效價趨于接近．其中，vP95K/EGFP/339-在96h已經(jīng)達到與AcEGFP一致的水平，而vP95K/EGFP/339+復制較慢一些，但120h時效價仍達1.0×107TCID50/mL左右．進一步測定重組病毒基因組DNA的復制情況，如圖5所示．可以發(fā)現(xiàn)，感染后12h和18h，重組病毒基因組拷貝數(shù)明顯低于AcEGFP，但到24h時，3種病毒病毒基因組拷貝數(shù)接近．

3 討 論

P95蛋白及其同源蛋白是多種桿狀病毒的結(jié)構蛋白，也與病毒感染昆蟲活體有關[12-13]．但同時，有研究表明完整的P95蛋白對于AcMNPV在體外培養(yǎng)的細胞中復制是非必需的．本實驗室2008年曾報道剔除P95 N端的300多個氨基酸對病毒在Sf9細胞中的復制無明顯影響[8]．Zhu等[7]的結(jié)果也表明，編碼P95蛋白451～600位氨基酸的DNA片段(450bp)可以部分彌補p95基因缺失的影響，使病毒部分獲得產(chǎn)生子代病毒的能力[7]，但其效價僅為100 TCID50/mL左右．

圖4 重組病毒感染Sf9細胞后培養(yǎng)液中病毒效價Fig.4 Virus titers in the culture of Sf9 cells infected with recombinant virus

圖5 Sf9細胞中病毒DNA復制動態(tài)Fig.5 Replication dynamics of viral DNA in Sf9 cells infected with recombinant virus

本研究在實驗室前期工作的基礎上，進一步把對病毒復制起關鍵作用的片段定位到一段339bp的片段上．用該片段構建的重組病毒vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-都能得到高效價的重組病毒，效價水平與p95基因正常的病毒AcEGFP基本相當．Western blot實驗未能在這兩株病毒感染的細胞中檢測到P95蛋白，結(jié)合PCR檢測，證實這兩株病毒中的p95基因編碼區(qū)的大部分確已被置換而無法表達．同時，病毒復制動態(tài)分析表明，這兩株病毒無論在病毒DNA復制還是在出芽型病毒產(chǎn)生方面均稍慢于AcEGFP，vP95K/EGFP/339+在產(chǎn)生出芽型病毒方面又慢于vP95K/EGFP/339-，但DNA拷貝數(shù)在感染后24h，病毒效價在感染后120h時均與AcEGFP趨于一致．這些結(jié)果表明完整的P95蛋白對于病毒的復制不是必需的，其核心區(qū)域Core339對病毒的復制有關鍵的作用．同時也提示P95蛋白在病毒復制中仍發(fā)揮一定的作用．

Core339片段對應P95蛋白的565～677位氨基酸，與Zhu等[7]報道的451～600位氨基酸的結(jié)果有所重疊，但不盡一致．這應該是兩個研究中病毒效價差異的關鍵．我們前期的系列共轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)進一步縮短這個段序列會顯著降低病毒復制的水平，但相關結(jié)果還需要通過以構建重組病毒進一步驗證．Zhu等報道了帶有451～600區(qū)域的重組病毒(vAc83: del2-450/601-847)感染細胞后可檢測到與正常水平相當?shù)慕囟绦蚉95蛋白的表達，但本研究中，我們并未檢測到相應的條帶．這可能與Core339片段更小，其潛在表達的蛋白的分子質(zhì)量較小、不易檢測有關．

在前期實驗中，我們曾嘗試將Core339的PCR片段、質(zhì)粒、體外轉(zhuǎn)錄RNA(正向和反向)等與p95缺陷的bP95K/EGFP共轉(zhuǎn)染細胞，均觀察到病毒不同程度的復制(結(jié)果未顯示)．本研究驗證了這些結(jié)果的可靠性．值得注意的是，在本研究所構建的兩株重組病毒中，Core339插入位置兩側(cè)，一側(cè)是SV40 polyA信號序列，另一側(cè)是Tn7轉(zhuǎn)座子序列，沒有明顯的啟動子序列，而Core339片段以正向或反向插入都可以獲得病毒．因此，Core339片段是如何發(fā)揮作用的，值得探究．我們曾嘗試檢測該片段可能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并沒有得到明確的結(jié)果．此外，我們在研究病毒感染的細胞中microRNA動態(tài)時發(fā)現(xiàn)microRNAbantam是Sf9細胞中豐度最高的microRNA之一，對于病毒的感染和基因表達有一定作用[14]．序列比對發(fā)現(xiàn)Core339與bantam序列有明顯的同源性，似乎提示Core339可能參與干擾宿主microRNA的活性．但我們初步的研究未能得到明確支持這一假說的結(jié)果．

綜上，本研究的結(jié)果提示p95基因中的一段339bp的核心序列對病毒的復制具有關鍵作用，但它是如何發(fā)揮作用的還有待深入研究．

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