趙玲子，汪閱，楊炳君

?

谷胱甘肽修飾CdTe量子點與牛血紅蛋白相互作用的研究

趙玲子，汪閱，楊炳君

（吉林師范大學 環(huán)境科學與工程學院，吉林 四平 136000）

量子點是一種新型納米材料，其生物毒性及其環(huán)境影響日益受到社會的關(guān)注。通過紫外可見光譜和熒光光譜相互驗證，研究谷胱甘肽修飾CdTe量子點和牛血紅蛋白的相互作用。結(jié)果表明，CdTe量子點與牛血紅蛋白的作用微弱，牛血紅蛋白光譜特性的變化主要是由于微環(huán)境的改變引起的。這將為從分子水平上研究量子點的生物毒性提供理論依據(jù)。

谷胱甘肽； 碲化鎘量子點； 牛血紅蛋白(BHb）

量子點又稱為半導體納米晶體，是一種新型無極熒光探針[1]，具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)，發(fā)射峰可控且窄而對稱，量子產(chǎn)率高，抗光漂白性強等優(yōu)良的熒光特性[2]，常作為生物標記物和成像媒介被廣泛應用于化學、醫(yī)藥和生物等領(lǐng)域[3-5]。

隨著量子點應用日漸廣泛，人們逐漸意識到其存在的潛在危害，研究表明，量子點的毒性作用除了歸因于其尺寸效應[6]，其合成材料、合成方法不同導致的化學性質(zhì)的變化也是關(guān)鍵因素[7]，這使得對于量子點的生物毒性評價和比較變得復雜。目前，有關(guān)量子點與生物大分子相互作用已經(jīng)有很多研究報道[8，9]，但這些研究大多數(shù)都沒有考慮到熒光內(nèi)濾現(xiàn)象，而熒光內(nèi)濾的存在會為實驗結(jié)果帶來很大的誤差，從而得出錯誤的結(jié)論。

本文將會在考慮熒光內(nèi)濾效應的情況下，選取血液循環(huán)系統(tǒng)中的血紅蛋白為研究對象，運用熒光光譜和紫外可見吸收光譜等手段對量子點與牛血紅蛋白的相互作用進行研究，為量子點的生物毒性研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

Na2TeO3（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），谷胱甘肽、牛血紅蛋白（純度大于99%，美國Sigma公司），NaBH4（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），CdCl2·2.5H2O、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、異丙醇均為分析純，購自天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

紫外-可見分光光度計（TU-1810，北京普析通用儀器有限責任公司）；熒光分光光度計（安捷倫科技有限公司）；電子分析天平（BSA124S，賽多利斯科學儀器有限公司）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，上海科升儀器有限公司）。

1.3 量子點的合成

在三口燒瓶中依次加入6 ml 0.1 mol/L的CdCl2、還原型谷胱甘肽0.225 0 g。用1 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)pH值到9，加入少量水，之后加入0.100 0 g的NaBH4以及一定量的Na2TeO3，定容至100 mL，10 min將三口燒瓶置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中100 ℃加熱回流2 h。取剛剛制備的量子點溶液，加入2倍體積的異丙醇，用移液槍吹打均勻后，移至離心機中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速到6 000 r/min，離心時間10 min，棄掉上層清液，用超純水分散后備用。

1.4 量子點與BHb相互作用的紫外可見吸收光譜測定

將0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O按81∶19的比例混合，配制成pH為7.4的緩沖溶液。將1 mL的0.2 mol/L的PBS緩沖溶液，1 mL 3×10-5mol/L的BHb溶液以及一定濃度梯度的CdTe量子點溶液加入到10 mL容量瓶中，加水定容，穩(wěn)定30 min后，利用紫外-可見分光光度計測定。參數(shù)設置：掃描速度為快速，波長范圍250~450 nm，狹縫寬度1 nm。

1.5 量子點與BHb相互作用的熒光光譜測定

取6個10 mL的容量瓶，分別加入1 mL pH為7.4的PBS緩沖溶液，然后再分別加入一定濃度梯度的CdTe量子點溶液，之后各加入1 mL的3×10-5mol/L的BHb溶液，加入超純水定容，穩(wěn)定30 min，對體系進行熒光光譜的檢測。

熒光發(fā)射光譜參數(shù)設置：激發(fā)波長278 nm，掃描范圍290~450 nm，掃描電壓700 V，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。同步熒光參數(shù)設置：初始激發(fā)波長250 nm，波長差分別為15 nm(酪氨酸)和60 nm(色氨酸)。

1.6 熒光內(nèi)濾的計算

熒光內(nèi)濾是指溶液對激發(fā)和發(fā)射光的吸收所形成的熒光下降[10]。因此，為更清晰的解釋實驗現(xiàn)象，需要去掉熒光內(nèi)濾的影響，采用Lakowicz的校正公式校正熒光光譜的數(shù)值[11]：

cor=obs×10（ex+em）/2 （1）

式中：cor——校正后的熒光數(shù)值；

obs——測定的熒光數(shù)值；

ex——激發(fā)波長處的吸收值；

em——發(fā)射波長處的吸收值。

2 結(jié)果與討論

2.1 量子點對BHb紫外可見吸收光譜的影響

BHb在278 nm和406 nm處有兩個顯著的吸收峰，它們分別是蛋白質(zhì)分子中含苯環(huán)的氨基酸殘基（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）的吸收峰和血紅素的特征峰。由圖1可以看出，隨著量子點濃度的增加，兩個吸收峰的強度均逐漸減弱，但下降的幅度不大，說明量子點與血紅蛋白發(fā)生了微弱的相互作用。

圖1 不同濃度CdTe量子點暴露下BHb的紫外吸收光譜

Conditions: BHb: 3×10-5mol L-1; CdTe QDs/×10-7mol L-1: (1) 0, (2) 0.207, (3) 0.414, (4) 0.828. pH=7.4

2.2 量子點對BHb熒光光譜的影響

熒光猝滅是指能夠?qū)е聼晒夤w熒光強度降低的物理或化學過程，由于其高度的靈敏性被廣泛地用于化學及生物化學的定量分析中。熒光猝滅分析中一個重要且不能避免的問題就是猝滅劑對熒光體發(fā)射波長和激發(fā)波長的吸收，這會導致猝滅率虛高的現(xiàn)象，被稱為內(nèi)濾效應。內(nèi)濾效應會影響對于結(jié)果的分析，因此有必要對內(nèi)濾效應進行校正，否則觀察和計算出的結(jié)果會有很大的差異。

圖2為未進行內(nèi)濾校正時CdTe量子點對BHb熒光光譜光譜的影響，由圖可以看出隨著CdTe量子點濃度的增加，BHb熒光強度逐漸下降，且峰值變化幅度很大，說明CdTe量子點與BHb存在著顯著的相互作用。

圖2 不同濃度CdTe量子點暴露下BHb的熒光發(fā)射光譜

（無內(nèi)濾校正）

Conditions: BHb: 3×10-5mol L-1; CdTe QDs/×10-7mol L-1: (a) 0, (b) 0.207, (c) 0.414, (d) 0.621, (e) 0.828, (f) 1.035. pH=7.4; T﹦298 K

圖3 不同濃度CdTe量子點暴露下BHb的熒光發(fā)射光譜

（內(nèi)濾校正后）

由圖3可知，當考慮熒光內(nèi)濾時，隨著CdTe量子點濃度的增加，BHb 340 nm處的發(fā)射峰強度變化幅度減小，且峰位置沒有變化，說明CdTe量子點與BHb的相互作用是微弱的，其發(fā)射峰強度的變化主要是由于BHb所處微環(huán)境的改變引起的。

2.3 同步熒光光譜分析

由圖4、5可以看出，當考慮熒光內(nèi)濾時，BHb中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光峰值變化的幅度很小，再次說明量子點與BHb的相互作用很微弱。

圖4 不同濃度CdTe量子點暴露下BHb的同步熒光光譜(Δλ=60 nm)（內(nèi)濾校正后）

圖5 不同濃度CdTe量子點暴露下BHb的同步熒光光譜 (Δλ=15 nm)（內(nèi)濾校正后）

3 結(jié) 論

本文主要運用紫外可見吸收光譜和熒光光譜手段研究了CdTe量子點與BHb的相互作用。研究表明，隨著CdTe量子點濃度的增加，BHb的兩個吸收峰強度均逐漸下降，但下降幅度不大，這說明量子點與牛血蛋白發(fā)生了微弱的相互作用。熒光光譜分析結(jié)果顯示，不考慮熒光內(nèi)濾的條件時，BHb的熒光特征峰強度隨量子點濃度的增加出現(xiàn)大幅下降，說明二者相互作用顯著；當考慮熒光內(nèi)濾時，BHb的熒光特征峰強度變化幅度很小，說明實際情況是碲化鎘量子點與BHb雖然發(fā)生了相互作用，但反應微弱，BHb熒光強度的變化，主要是微環(huán)境的變化所引起的。從整個實驗中也證明了考慮熒光內(nèi)濾的重要性。

［1］陳海燕，胡琴. 量子點作為熒光探針在生物樣品檢測中的應用及進展[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2015, 46 (2) :207-211.

［2］宋爾群，魏宏，宋楊. 量子點細胞毒性效應研究進展[J]. 環(huán)境化學, 2011, 30(3): 585-590.

［3］劉星, 羅陽. 量子點生物傳感器中的表面修飾技術(shù)及其醫(yī)學應用[J]. 分析化學, 2014, 42(7): 1061-1069.

［4］嚴拯宇, 肖岸,呂華, 等. ZnO摻雜碳量子點的流動注射化學發(fā)光法測定甲硝唑[J]. 新型炭材料, 2014, 29(3): 216-224.

［5］衛(wèi)會云, 王國帥, 吳會覺.量子點敏化太陽能電池研究進展[J]. 物理化學學報, 2016, 32 (1): 201-213.

［6］祝欣，董朝青，王金杰，等.水相合成CdTe量子點對人宮頸癌細胞(SiHa)的毒性研究[J]. 分析科學學報, 2011, 27(6): 681-687.

［7］李崢，汪勇先，張國欣，韓彥江.穩(wěn)定劑對水相制備CdTe量子點的熒光性能和細胞毒性影響研究[J]. 無機材料學報, 2010, 25(5): 495-499.

［8］楊冬芝，孫世安，陳啟凡，徐淑坤. CdSe量子點與蛋白質(zhì)的作用研究[J]. 激光生物學報, 2007, 16(5): 527-531.

［9］Lingzi Zhao, Rutao Liu, Xingchen Zhao, Bingjun Yang, et. New strategy for the evaluation of CdTe quantum dot toxicity targeted to bovine serum albumin. Science of the total environment, 2009, 407: 5019-5023.

［10］Fery-Forgues S, Lavabre D. Are fluorescence quantum yields so tricky to measure? A demonstration using familiar stationery products [J]. Journal of Chemical Education, 1999, 76(9): 1260-1264.

［11］Lakowicz J R. Principles of fluorescence spectroscopy [M]. Springer Verlag, 2006．

Study on the Interaction Between Glutathione Modified CdTe Quantum Dots and Bovine Hemoglobin

,,

（College of Environmental Science and Engineering, Jilin Normal University, Jilin Siping 136000, China）

Quantum dot is a new type of nanometer material, its biological toxicity effect and impact on the environment increasingly attract the attention of society. In this paper, the interaction between GSH modified CdTe quantum dots and bovine hemoglobin was studied by UV-visible spectra and fluorescence spectra. The results showed that the interaction between CdTe quantum dots and bovine hemoglobin was weak, and the change of the spectral characteristics of bovine hemoglobin was mainly due to the change of microenvironment. This paper will provide a theoretical basis for studying the biotoxicity of quantum dots at the molecular level.

glutathione; CdTe quantum dots; bovine hemoglobin (BHb)

TQ 033

A

1004-0935（2017）10-0951-03

2017-08-30

趙玲子（1984-），女，講師，碩士，山東淄博人，2010年畢業(yè)于山東大學環(huán)境科學專業(yè)，研究方向：環(huán)境污染與健康。