范小瑞，張禛，席華明，梁亞俊，賀俊平

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熱應激對豬睪丸Cyt-C和Caspase-3表達的影響

范小瑞，張禛，席華明，梁亞俊，賀俊平

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801）

【目的】環(huán)境高溫影響豬精子發(fā)生和精液品質(zhì)，但其分子機制尚不清楚。為此探索環(huán)境溫度升高導致的熱應激對豬睪丸細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Cyt-C和Caspase-3表達的影響。【方法】性成熟長白公豬9頭，對照組3頭，飼養(yǎng)在20—27℃的豬舍環(huán)境；短期熱應激處理組（heat stress 7 d，HS7d）3頭，每天置37—40℃的豬舍環(huán)境3 h，連續(xù)7 d；一個精子發(fā)生周期熱應激處理組（heat stress 42 d，HS42d）3頭，每天置37—40℃的豬舍環(huán)境3 h，連續(xù)42 d；每天于熱應激處理后將豬驅(qū)趕回20—27℃的豬舍。手術摘取睪丸組織，用QRT-PCR、Western blot和免疫組織化學方法檢測Cyt-C和Caspase-3表達與定位的變化。【結(jié)果】 QPT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，熱應激處理7 d組和42 d組，Cyt-C和Caspase-3mRNA的相對表達量均顯著升高；熱應激處理7 d組Cyt-C和Caspase-3mRNA的相對表達量最高。Western blot結(jié)果顯示，熱應激處理7 d組和42 d組Cyt-C和Caspase-3蛋白水平與對照組相比均顯著升高；熱應激處理7 d組Cyt-C和Caspase-3的蛋白表達水平最高。免疫組織化學研究發(fā)現(xiàn)，Cyt-C在豬睪丸組織中免疫反應陽性物定位于間質(zhì)細胞、支持細胞和各個發(fā)育階段生精細胞的胞質(zhì)中，在生精細胞Cyt-C低表達于精原細胞，高表達于減數(shù)分裂后精母細胞和精子細胞。熱應激處理導致Cyt-C的胞質(zhì)內(nèi)定位更加彌散，提示Cyt-C從線粒體到胞質(zhì)的釋放。Caspase-3在間質(zhì)細胞和精原細胞低表達，大量減數(shù)分裂后的生精細胞呈Caspase-3陽性。與對照組相比，熱應激處理導致部分支持細胞Caspase-3的表達，大量生精細胞的細胞核呈Caspase-3陽性著色?！窘Y(jié)論】高溫熱應激處理導致豬睪丸Cyt-C和Caspase-3的蛋白和mRNA表達水平升高、細胞定位改變，提示Cyt-C和Caspase-3可能與熱應激導致的豬精液品質(zhì)下降存在關聯(lián)。

熱應激；公豬；睪丸；Cyt-C；Caspase-3

0 引言

【研究意義】高溫熱應激嚴重影響種豬性欲和精液品質(zhì)，進而影響種豬繁殖率[1-3]。探明熱應激損傷豬精子發(fā)生和精液品質(zhì)的分子機制，并提出應對措施，對種豬繁殖實踐具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】對熱應激損傷實驗動物小鼠[4]、大鼠[5-6]和猴[7]的精子發(fā)生分子機制的研究發(fā)現(xiàn)，部分原因是熱應激誘導細胞凋亡，導致生殖細胞減少，進而導致少精癥和無精癥。細胞凋亡信號途徑在進化中高度保守。蛋白酶Caspases（cysteine aspartic acid specific protease）家族成員在細胞凋亡調(diào)節(jié)中起重要作用。在哺乳動物細胞中，Caspases依賴的細胞凋亡主要由兩條途徑引發(fā)：由死亡受體起始的外源途徑和由線粒體起始的內(nèi)源途徑。細胞凋亡的內(nèi)源途徑中，線粒體細胞色素C（Cyt-C）從線粒體釋放到胞質(zhì)中是細胞凋亡內(nèi)源信號途徑的關鍵。Cyt-C釋放到胞質(zhì)中，與胞質(zhì)的Apaf-1（apoptosis protease activating factor）分子結(jié)合，激活Caspase-9酶原，進而激活Caspase-3酶原，Caspase-3的活化，細胞凋亡將不可避免的發(fā)生[8-10]。熱應激誘發(fā)細胞凋亡見于陰囊和睪丸局部受熱[11]和精索靜脈曲張[12]。用40℃或42℃溫水浴處理小鼠睪丸30 min，Caspase-3表達增加，大量生精細胞死亡[13]。Caspase-3由細胞質(zhì)進入細胞核是其發(fā)揮促凋亡作用所必需，但其機制尚不清[14]。另外，小鼠缺乏睪丸特異性Cyt-C，精子功能受損[15]。Cyt-C在生殖細胞和支持細胞數(shù)量比例的維持中也發(fā)揮著十分重要的作用[16-17]。Caspase-3基因敲除小鼠，Cyt-C的釋放受到抑制，而活化的Caspase-3以正反饋的形式，進一步刺激Cyt-C向胞質(zhì)的釋放，進一步加速細胞凋亡[18]?！颈狙芯壳腥朦c】高溫影響豬精子發(fā)生和精液品質(zhì)，但分子機制不清楚。來自其他哺乳動物的研究提示，細胞凋亡與凋亡調(diào)節(jié)蛋白在熱應激損傷精子發(fā)生中起重要作用，細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制研究認為線粒體細胞色素C釋放到胞質(zhì)中，并最終激活Caspase-3蛋白酶，起始細胞凋亡。熱應激對這兩種細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白在豬睪丸表達是否有影響，未見報道?！緮M解決的關鍵問題】高溫熱應激條件下，用QRT-PCR法、Western blot法和免疫組織化學法研究熱應激對性成熟豬睪丸Cyt-C和Caspase-3mRNA蛋白表達與組織細胞定位的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及處理

140 kg左右，14月齡，健康狀況良好的性成熟長白公豬9頭，飼養(yǎng)在20—27℃的豬舍環(huán)境；隨機分成3組，其中3頭，置37—40℃的豬舍環(huán)境，每天3 h，連續(xù)7 d，為短期熱應激處理組（heat stress 7 d，HS7d）；3頭置37—40℃的豬舍環(huán)境，每天3 h，連續(xù)42 d，為一個精子發(fā)生周期熱應激處理組（heat stress 42 d，HS42d）；每天在熱應激處理結(jié)束后，將豬驅(qū)趕回20—27℃的豬舍；其余3頭豬整個試驗期保留在20— 27℃的豬舍，為對照組（control，CON）。試驗時間為2015年7、8月份，地點為太谷縣某養(yǎng)殖場。熱應激處理結(jié)束24 h，各組試驗用豬，手術法摘取豬睪丸組織，將部分睪丸組織切成小塊，迅速分裝于凍存管，凍存于液氮，用于總RNA和總蛋白的提取。部分睪丸組織切成的小塊，迅速置于Bouin氏固定液中，4℃冰箱固定12 h，后轉(zhuǎn)入70%酒精，經(jīng)脫水、透明、浸蠟，用于制作石蠟切片。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取和QPT-PCR的擴增 Trizol法提取總

RNA（Trizol Readent，Invitrogen公司產(chǎn)品），1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用ND-1000（NanDrop Technologies）測定其濃度。用QIAGEN公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成，去除基因組DNA，反應體系為：gDNA Wipeout Buffer，7×：2 μL；總 RNA：1 μg；加至14 μL，體系混勻后置于PCR儀中，按條件：42℃ 2 min進行反應；cDNA合成，反應體系為：Quantiscript RT Buffer, 5×：4 μL；RT Primer Mix：1 μL；Reverse-transcription master mix：1 μL；Template RNA（Entire genomic DNA elimination reacton）：14 μL，體系混勻置于PCR儀中，按條件：42℃，30 min；95℃，3 min進行反應，-20℃保存cDNA。參照NCBI給出的Cyt-C和Caspase-3基因全序列中的CDS序列使用primer premier 5.0軟件設計熒光定量RCR擴增引物，交由華大基因合成，引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列及擴增條件

用QIAGEN試劑盒（QuantiFast SYBR Green PCR Kit，QIAGEN公司產(chǎn)品）進行熒光定量PCR，18SrRNA作為內(nèi)參基因與Cyt-C和Caspase-3共同進行擴增，每個樣品重復3次，置于Stratagene Mx3005P 實時熒光定量PCR儀（Stratagene Agilent，USA）上反應。根據(jù)擴增曲線的CT值計算定量結(jié)果。通過2-ΔΔCT計算Cyt-C和Caspase-3在對照組和試驗組豬睪丸中的相對表達水平。18SrRNA標準化Cyt-C和Caspase- 3mRNA的相對表達量。

1.2.2 Western blot 分析 用蛋白提取試劑盒（碧云天公司產(chǎn)品）提取睪丸組織總蛋白，用ND-1000測定蛋白質(zhì)濃度。每空上樣量為200 μg 蛋白樣品，進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜；5%脫脂奶粉封閉1 h；TBST沖洗，加入第一抗體（多克隆兔抗Cyt-C，TBST1000倍稀釋；多克隆兔抗Caspase-3，5%脫脂奶粉200倍稀釋；單克隆兔抗GAPDH，TBST2500倍稀釋；一抗均為Abcam公司產(chǎn)品）覆蓋NC膜，室溫放置30 min，4℃過夜；第2天取出，室溫放置30 min，TBST沖洗10 min×3，加入山羊抗兔IgG抗體（TBST6000倍稀釋，康為世紀公司產(chǎn)品），37℃孵育1 h，TBST沖洗5 min×6；加入高靈敏度發(fā)光試劑（康為世紀公司產(chǎn)品），膠片曝光。用ImageJ（National Institutes of Health，USA）進行分析。

1.2.3 免疫組織化學 石蠟切片經(jīng)脫蠟至水，用新配置3% H2O237℃孵育10 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS（PH7.4）沖洗3 min×3；正常山羊血清封閉液37℃孵育10 min；分別滴加第一抗體（多克隆兔抗Cyt-C，BSA1000倍稀釋；多克隆兔抗Caspase-3，BSA100倍稀釋，第一抗體均為Abcam公司產(chǎn)品），室溫放置30 min，之后置4℃冰箱過夜；第2天取出，室溫放置30 min，PBS沖洗3 min×3，滴加第二抗體（多聚化山羊抗兔IgG，康為世紀公司產(chǎn)品），37℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3；DAB（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品）顯色，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。棕紅色著色判定為免疫反應陽性，根據(jù)陽性著色的深淺和范圍，確定表達水平的高低。陰性對照切片，用正常非免疫兔血清代替第一抗體。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）與顯著性檢驗，差異顯著＜0.05，差異極顯著＜0.01。所有實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤（mean±SEM）”表示。

2 結(jié)果

2.1 熱應激對Cyt-C和Caspase-3 mRNA相對表達水平的影響

QRT-PCR研究顯示，對照組Cyt-CmRNA的相對表達量為0.8340±0.0196，熱應激處理7 d和42 d組Cyt-CmRNA的相對表達量升高，分別為2.1742± 0.1212、1.1254±0.0414，分別是對照組的2.61倍（＜0.01）、1.35倍（＜0.05）（圖1-A）。對照組Caspase- 3mRNA的相對表達量為1.0068±0.1130，熱應激處理7 d和42 d組Caspase-3 mRNA的相對表達量升高，分別為3.7975±0.3391、3.0010±0.5516，分別是對照組的3.77、2.99倍（＜0.01）（圖1-B）。

A. Cyt-CmRNA相對表達量；B. Caspase-3mRNA相對表達量。CON：對照組；HS7 d：熱應激7 d組；HS42 d：熱應激42 d組。* P＜0.05; ** P＜0.01

2.2 熱應激對Cyt-C和Caspase-3蛋白相對表達量的影響

Western blot研究顯示，各試驗豬睪丸組織提取物中存在分別與多克隆兔抗Cyt-C和多克隆兔抗Caspase-3進行免疫反應的陽性條帶，分子量分別為12和32 kD（圖2-A）。對照組Cyt-C蛋白水平相對表達量為0.4455±0.0644，熱應激處理7 d和42 d組Cyt-C蛋白水平相對表達量升高，分別為0.9069± 0.0446、0.7332±0.0724，分別是對照組的2.04倍、1.65倍（＜0.01）（圖2-B）。對照組Caspase-3蛋白水平相對表達量為0.1768±0.0308，熱應激處理7 d和42 d組Caspase-3蛋白水平相對表達量升高，分別為0.5974±0.0390、0.3574±0.0742，分別是對照組的3.38倍（＜0.01）、2.02倍（＜0.05）（圖2-C）。

2.3 免疫組織化學試驗

2.3.1 Cyt-C在豬睪丸中免疫組織化學染色 Cyt-C

在豬睪丸組織中免疫反應陽性物（棕色著色）定位于間質(zhì)細胞、支持細胞和各個發(fā)育階段生精細胞的胞質(zhì)中，在生精細胞Cyt-C低表達于精原細胞，高表達于減數(shù)分裂后精母細胞和精子細胞。與對照組相比，熱處理（HS7d，HS42d）導致Cyt-C的胞質(zhì)內(nèi)定位更加彌散，鑒于線粒體為直徑0.3—1.0 μm，長短1.5—3.0 μm大小的線狀、顆粒狀小體，更細小的彌散分布提示Cyt-C脫離線粒體進入細胞質(zhì)定位。陰性對照切片，以正常非免疫兔血清代替一抗，未見特異性著色（圖3）。

2.3.2 Caspase-3在豬睪丸中免疫組織化學染色 Caspase-3在各組睪丸的細胞定位大體相似，間質(zhì)細胞和精原細胞低表達，大量減數(shù)分裂后的生精細胞呈Caspase-3陽性表達（棕色著色）。與對照組相比，熱處理（HS7d，HS42d）導致部分支持細胞和管周肌樣細胞Caspase-3陽性表達，大量圓形和長形精子細胞的細胞核呈Caspase-3陽性表達，Rs所指圓形為圓形精子細胞的細胞核（圖4-F,J），Es所指橢圓形為長形精子細胞的細胞核（圖4-G,K）。陰性對照切片，以正常非免疫兔血清代替一抗，未見特異性著色（圖4）。

3 討論

Caspase-3是介導細胞凋亡的關鍵效應酶，是凋亡執(zhí)行的重要效應分子，以無活性的酶原形式存在于活細胞的胞質(zhì)中[10]。Caspase-3在哺乳動物睪丸的表達有大量報道，Caspase-3表達于人類精子發(fā)生過程中各級生精細胞和支持細胞[19]；小鼠精子發(fā)生過程中的精原細胞和精母細胞[13,20]；大鼠精子發(fā)生過程中的精母細胞[21]；新生羊駝間質(zhì)細胞和各級生精細胞[22]；鯰魚精子細胞[23]；Caspase-3在各種動物睪丸生精細胞中的表達，提示Caspase-3與精子發(fā)生密切相關，但其機制尚不清楚。

本項研究中Caspase-3蛋白和mRNA表達水平在熱應激處理（37℃ 3 h連續(xù)7 d和42 d）豬睪丸顯著升高。短期熱應激處理（7 d）導致Caspase-3蛋白和mRNA表達升高。這與 JIA等對獼猴[7]和大鼠[24]睪丸的研究結(jié)果相似。參照文獻報道，野豬的精子發(fā)生周期為41 d，本項研究中連續(xù)42 d（一個精子發(fā)生周期）熱處理組豬睪丸Caspase-3蛋白和mRNA的表達高于對照組，但較7 d熱處理組降低，這一方面可能是由于細胞對熱刺激一定程度的調(diào)整適應；另一方面，也提示細胞在長期熱應激環(huán)境條件下，以凋亡信號途徑應對不良環(huán)境刺激的能力降低。

本項研究Caspase-3免疫組織化學結(jié)果顯示，Caspase-3低表達于間質(zhì)細胞和精原細胞，大量減數(shù)分裂后的生精細胞呈Caspase-3陽性。與對照組相比，熱處理導致部分支持細胞Caspase-3的表達，大量生精細胞的細胞核呈Caspase-3陽性著色（棕色）。先前的研究證實，Caspase-3以酶原的形式存在于正常細胞的胞質(zhì)中，Caspase-3高表達于減數(shù)分裂以后生精細胞，提示減數(shù)分裂以后細胞易于接受凋亡信號的刺激，是當受到熱應激刺激時容易發(fā)生凋亡的細胞類型，這一點在有關熱應激誘導的細胞凋亡類型已有證實[19,25-26]。支持細胞是曲精小管內(nèi)唯一與生精細胞接觸的體細胞，為生精細胞的發(fā)育提供營養(yǎng)支持。熱處理導致支持細胞Caspase-3的陽性表達，提示熱應激處理可能導致支持細胞啟動細胞凋亡途徑，而這一點對精子發(fā)生的損失是不可逆的。Caspase-3由細胞質(zhì)進入細胞核定位是其發(fā)揮促凋亡作用所必需[27]。本項研究中，熱處理導致大量精子細胞表現(xiàn)細胞核Caspase-3陽性著色（棕色），提示精子細胞是易于發(fā)生細胞凋亡的主要細胞類型。

細胞色素C是一種水溶性蛋白，分子量約為12 kD，位于線粒體內(nèi)膜，是電子傳遞鏈的重要組成部分。線粒體釋放到胞漿中的Cyt-C可通過與Apaf-1（apoptosis protease activating factor）結(jié)合，激活Caspase-9，并進而活化Caspase-3，介導細胞凋亡。本項研究中，熱應激處理導致Cyt-C蛋白和mRNA的表達升高，熱應激處理7 d導致Cyt-C蛋白和mRNA的表達顯著升高，這與JIA等對獼猴[7]和大鼠[24]睪丸Cyt-C的研究結(jié)果相似。熱處理42 d組Cyt-C蛋白和mRNA的表達水平較對照組高，但低于7 d組，這提示短期熱應激處理可能導致細胞代謝加快，細胞凋亡的傾向性升高；而長期熱應激環(huán)境（一個精子發(fā)生周期），Cyt-C的高表達有所恢復，提示細胞對熱應激有一定的調(diào)整能力，逐漸恢復到較低水平。

Cyt-C免疫組織化學定位顯示，整個睪丸組織的各類細胞均有Cyt-C的表達，這與文獻[16]的研究報道相似。本項研究發(fā)現(xiàn)不同細胞類型Cyt-C的表達量高低有明顯差別，精原細胞Cyt-C的表達量小，而減數(shù)分裂后生精細胞Cyt-C的表達水平高；結(jié)合Cyt-C是線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈的重要組分，Cyt-C表達水平的高低反映細胞代謝水平的高低；這就提示精原細胞代謝水平較低，對細胞凋亡信號的刺激反應弱；減數(shù)分裂以后生精細胞代謝水平高，對細胞凋亡信號的反應強。

對照組Cyt-C的表達呈現(xiàn)彌散顆粒狀，提示Cyt-C局限在線粒體區(qū)域，Cyt-C高表達于精母細胞和精子細胞，說明精母細胞和精子細胞線粒體含量豐富，而精原細胞線粒體含量少。與對照組相比，熱應激處理組Cyt-C的表達呈現(xiàn)出彌散細點狀，提示Cyt-C有脫離線粒體進入細胞質(zhì)定位的特征。

試驗期間，熱應激組豬在進入37—40℃的豬舍時，有煩躁不安、不愿進入熱圈的反應，反復驅(qū)趕對試驗結(jié)果也會產(chǎn)生一定影響，本結(jié)果實際反映了熱應激及驅(qū)趕的綜合應激效應。

綜上所述，熱應激處理導致線粒體的表達水平升高和向胞質(zhì)的釋放量增加，通過信號分子激活Caspase-3，使Caspase-3表達水平升高，在減數(shù)分裂后的生精細胞細胞核的定位增加，活化的Caspase-3進一步反饋性調(diào)節(jié)使Cyt-C向胞質(zhì)的釋放增加，活化的Caspase-3增加，影響精子發(fā)生，導致精液品質(zhì)下降。

4 結(jié)論

熱應激處理導致線粒體細胞色素C和Caspase-3在豬睪丸mRNA和蛋白表達水平的增加，在睪丸組織細胞定位發(fā)生變化：線粒體細胞色素C脫離線粒體進入細胞質(zhì)定位，Caspase-3由細胞質(zhì)進入細胞核定位，提示線粒體細胞色素C和Caspase-3可能與熱應激導致的豬精液品質(zhì)下降存在關聯(lián)。

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（責任編輯 林鑒非）

Effect of Heat Stress on the Expression of Cyt-C and Caspase-3 in Boar Testis

FAN XiaoRui, ZHANG Zhen, XI HuaMing, LIANG YaJun, HE JunPing

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi）

【Objective】 Elevated ambient temperature has detrimental effects on sperm quality in mammalian species including pig. But the molecular mechanism has not yet well understood. The aims of present study were to investigate the effect of heat stress on the expression of Cyt-C and Caspase-3 in boar testis. 【Method】 Nine mature boars (Landrace, 18 months of age) were used in the study. Three boars were subjected to 37-40℃ for 3 h daily for 7 days (heat stress 7 d, HS7d). Three boars were subjected to 37-40℃ for 3 h daily for 42 days (heat stress 42 d, HS42d). Following daily heat treatment the boars were driven back to normal house (20-27℃). The other 3 boars were kept in the normal house as control group (20-27℃). All boars were castrated and the testes were harvested. Western blot, QRT-PCR, and immunohistochemistry were used to analyze the expression of Cyt-C and Caspase-3. 【Result】 QRT-PCR showed that mRNA expression of Cyt-C and Caspase-3 were all increased in HS7d group and HS42d group compared with the control. And the relative expression of Cyt-C and Caspase-3mRNA in HS7d group was the highest. Western blot showed that the protein expression of Cyt-C and Caspase-3 was all increased in HS7d and HS42d as well, compared with the control group. And the protein expression of Cyt-C and Caspase-3 in HS7d group was the highest. Immunohistochemistry found that Cyt-C localized in the cytoplasm of Leydig cells, Sertoli cells and all stages of germ cells. In spermatogonia, the Cyt-C expression was low, while in postmeiosis germ cells, the expression of Cyt-C was higher. Heat treatment resulted in a more diffuse cytoplasmic localization of Cyt-C, which suggested that Cyt-C was released from mitochondria to the cytoplasm. In Leydig cells and spermatogonia, the Caspase-3 expression was low. A large number of postmeiosis germ cells showed Caspase-3 positive immunoreactive staining. Heat stress resulted in some Sertoli cells Caspase-3 positive staining and Caspase-3 positive with nucleus staining increased.【Conclusion】Elevated ambient temperature induced the increase of the expression of Cyt-C and Caspase-3, and the changes of cellular location, which indicated that the expression change of Cyt-C and Caspase-3 may be associated with the sperm quality decrease induced by heat stress.

heat stress; boar; testis; Cyt-C; Caspase-3

2016-05-11；接受日期：2017-01-10

國家自然科學基金項目（31470124）

范小瑞，E-mail：m18404981554@163.com。 通信作者賀俊平，E-mail：dnhjp@163.com