李天芝，于新友，沈志強(qiáng)

(1.山東綠都生物科技有限公司，濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600)

牛源致病性大腸桿菌O78型的分離與鑒定

李天芝1，于新友1，沈志強(qiáng)2

(1.山東綠都生物科技有限公司，濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600)

本研究對(duì)山東省東營市某牛場病死牛的病料進(jìn)行了病原菌的分離，并對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、PCR鑒定、藥敏試驗(yàn)和動(dòng)物致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，本研究成功分離到一株O78型大腸桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該菌株具有多重耐藥性；致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株對(duì)昆明系小白鼠具有一定的致病性。

牛源；致病性大腸桿菌；分離；鑒定

2016年3月份，山東省東營市某牛場新生犢牛出現(xiàn)不同程度的食欲不振、精神沉郁、不愿站立、呼吸急促、全身衰弱、排灰白色水樣稀糞和肛門周圍、腹部及后肢有糞便黏附癥狀，有的病牛眼眶下陷，最后陷入脫水狀態(tài)，衰竭死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)有灰白色稀糞，混有血絲和氣泡，腸黏膜出血，部分腸黏膜脫落，腸系膜淋巴結(jié)腫大，真胃有凝乳塊，胃黏膜水腫、充血，肝臟有出血點(diǎn)，心內(nèi)膜出血。筆者通過試驗(yàn)排除了球蟲、隱孢子蟲、牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒感染的可能，從病死牛的肝臟和腸系膜淋巴結(jié)病料中分離鑒定出一株O78型牛大腸桿菌，并對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)，為該菌株的后續(xù)工作奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料

無菌采取病死牛部分肝臟、腸系膜淋巴結(jié)作為病料。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

20只18～22g清潔級(jí)昆明系小白鼠購自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 試劑及耗材草酸銨結(jié)晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復(fù)紅染液、血瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和肉湯液體培養(yǎng)基均由本公司質(zhì)檢部提供；DL2000 Marker、TaqDNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；藥敏紙片、糖發(fā)酵管及生化試驗(yàn)用各種試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司；大腸桿菌O型單價(jià)陽性標(biāo)準(zhǔn)血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中大腸桿菌LEE毒力島的eaeA基因序列(AJ223063)，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物：5′-ATAAACCGTGGTCTCAGCAAATCG -3′，下游引物：5′- ATCACCATCAATACTCAACGGG -3′，擴(kuò)增片段1 043bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 寄生蟲和輪狀病毒檢查

取新鮮牛糞便2～3g放于量杯，加入30mL飽和食鹽水，攪拌，混和均勻，用雙層紗布過濾，收集濾液，靜置半小時(shí)，用金屬圈水平沾取液面，顯微鏡下檢測(cè)有無球蟲卵囊。

按照李安平等[1]、于新友等[2、3]的方法檢測(cè)糞便中是否有隱孢子蟲、牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒。

1.4.3 細(xì)菌檢測(cè)與分離培養(yǎng)

將病料涂片或觸片、干燥、固定，革蘭氏染色、鏡檢，篩選出具有細(xì)菌形態(tài)特征的病料。將這些病料劃線接種于血液瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，對(duì)可疑菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色及鏡檢。挑取單個(gè)可疑菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，觀察生長情況，對(duì)可疑菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色及鏡檢[4]。

1.4.4 生化鑒定

分離菌株經(jīng)營養(yǎng)瓊脂平板24h純培養(yǎng)后，分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)及其他生化試驗(yàn)。

1.4.5 PCR鑒定

挑取麥康凱營養(yǎng)瓊脂上單個(gè)菌落作為PCR的模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(50μL)：10×Buffer（含MgCl2）5μL，上下游引物各2μL（20pmol/L），dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，模板1μL，加水補(bǔ)足至50μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃ 5min；94℃ 50s，55℃ 50S，72℃ 50S，30個(gè)循環(huán)，72℃7min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。回收PCR產(chǎn)物，連pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑單菌落，振搖培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，再次鑒定，將陽性質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.4.6 藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法( K-B法)檢測(cè)該分離菌株的藥物敏感性，方法如下：將分離菌株的24h肉湯純培養(yǎng)物做10倍稀釋，用無菌棉簽均勻涂布于麥康凱營養(yǎng)瓊脂平板上；用無菌鑷子取藥敏紙片，均勻放于培養(yǎng)基表面，使紙片之間距離適當(dāng)，置37℃培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4.7 O抗原血清型鑒定

從麥康凱瓊脂平板上挑取單菌落，接種于肉湯培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)24h，離心取沉淀，加入0.5%滅菌石炭酸生理鹽水制成菌懸液，置于121℃下高壓2h，作為待檢抗原，取制備的待檢抗原和大腸桿菌O抗血清各10μL，在玻璃板上混勻，同時(shí)設(shè)生理鹽水陰性對(duì)照，觀察并記錄反應(yīng)結(jié)果，30s內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者判為陽性，否則為陰性。

1.4.8 致病性試驗(yàn)

將20只小白鼠隨機(jī)分成兩組，分別為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。取37℃24h肉湯純培養(yǎng)物(含菌量8×108CFU/mL)腹腔注射接種于小白鼠，0.1mL/只；對(duì)照組小白鼠腹腔注射肉湯，0.3mL/只。注射后隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況，并對(duì)死亡小白鼠進(jìn)行細(xì)菌分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 寄生蟲和輪狀病毒檢查

顯微鏡下檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，說明沒有球蟲感染。隱孢子蟲、牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2 細(xì)菌檢測(cè)與分離培養(yǎng)

腸系膜淋巴結(jié)、肝臟觸片革蘭氏染色鏡檢，可見兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。37℃培養(yǎng)24h后，在血瓊脂平皿上有大小均一、邊緣整齊、光滑、濕潤、乳白色、半透明、有光澤的圓形菌落生長。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上為邊緣整齊、表面光滑濕潤、圓形、桃紅色菌落。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上也有圓形、半透明菌落，肉湯培養(yǎng)基呈均勻渾濁狀。分別挑取單個(gè)菌落和渾濁菌液涂片進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢為中等大小、兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。

2.3 生化試驗(yàn)

由表1可知，該分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、果糖、木糖、半乳糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇，不能發(fā)酵肌醇、衛(wèi)矛醇、赤鮮醇、菊糖，V-P試驗(yàn)陰性，M-R試驗(yàn)陽性，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性，氧化酶、尿素酶陰性，硫化氫試驗(yàn)陰性，與大腸桿菌的生化特征一致。

表1 分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 PCR鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其片段大小與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。將該片段測(cè)序結(jié)果與GenBank登錄的大腸桿菌eaeA基因（AJ223063）進(jìn)行比對(duì)，相似性為100%。

圖1 大腸桿菌分離株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)

由表2可知，分離菌株對(duì)頭孢曲松、慶大霉素、氟苯尼考、硫酸新霉素高度敏感，對(duì)四環(huán)素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星中敏，對(duì)青霉素G、強(qiáng)力霉素、泰樂菌素、鏈霉素、氨芐西林、磺胺甲氧嘧啶耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 單位：mm

2.6 血清型鑒定結(jié)果

玻片凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌株的O抗原血清型為O78。

2.7 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組小白鼠注射分離菌株肉湯培養(yǎng)物2h后，出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振等癥狀，48h內(nèi)全部死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠小腸黏膜變薄且有出血點(diǎn)，腸系膜淋巴結(jié)水腫，肝臟出血、脾臟梗死，取死亡小鼠的心、肝和脾等組織在麥康凱平板上劃線培養(yǎng)，涂片染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)為革蘭氏陰性短小桿菌。對(duì)照組小白鼠均健活，剖檢未見異常。

3 討論

隨著養(yǎng)牛業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，犢牛腹瀉已成為一類重要疾病。引起犢牛腹瀉的原因有很多，可分為傳染性腹瀉和營養(yǎng)性腹瀉。傳染性腹瀉主要?dú)w因于各種細(xì)菌、病毒和寄生蟲的感染。寄生蟲主要包括球蟲和隱孢子蟲；病毒主要包括牛輪狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒；細(xì)菌主要是大腸桿菌。由大腸桿菌引起的犢牛腹瀉有著較高的發(fā)病率和死亡率[5]，主要發(fā)生于1月齡以內(nèi)的犢牛，一年四季均可發(fā)生，特別是氣候突變、飼養(yǎng)管理不當(dāng)和抵抗力下降時(shí)，有時(shí)呈地方性流行[6]，可導(dǎo)致犢牛大量死亡，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

eaeA基因是腸致病性大腸桿菌LEE毒力島上的標(biāo)志基因，編碼一種稱為緊密素的細(xì)菌外膜蛋白，介導(dǎo)細(xì)菌黏附于腸道上皮細(xì)胞[7]。本試驗(yàn)選取eaeA基因作為PCR鑒定的靶基因，可快速對(duì)分離菌株進(jìn)行分子水平的鑒定，從而為致病性牛大腸桿菌病的快速鑒定提供研究基礎(chǔ)。

由于養(yǎng)牛場長期不規(guī)范、不科學(xué)用藥，而大腸桿菌又極易產(chǎn)生可遺傳的耐藥質(zhì)粒[8]，所以牛大腸桿菌的抗藥性日益嚴(yán)重，給牛大腸桿菌病的治療造成很大的困難。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離菌株對(duì)頭孢曲松、慶大霉素、氟苯尼考、硫酸新霉素高度敏感，因此，可選取這些藥物進(jìn)行治療，提高療效，并且要多種藥物交替、輪換使用，以避免再次產(chǎn)生耐藥性。若牛場暴發(fā)細(xì)菌病，都應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌分離和藥敏試驗(yàn)，以便針對(duì)性地用藥，降低牛場損失。

大腸桿菌血清型眾多，對(duì)牛致病的大腸桿菌血清型主要有O15、O44、O55、O78、O86、O101、O141 和O125等[9,10]，各血清型之間的交叉保護(hù)性效果不好。臨床中大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型具有一定的區(qū)域性，可以篩選優(yōu)勢(shì)血清型且具有良好免疫原性的菌株制備多價(jià)苗進(jìn)行免疫預(yù)防。本研究分離出的血清型O78大腸桿菌，為進(jìn)行該分離菌的下一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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Isolation and Identification of Escherichia coli Serotype O78 from Cattle

LI Tian-zhi1, YU Xin-you1, SHEN Zhi-qiang2
(1.Shandong Lvdu Bio-Science and Technology Co.Ltd.,Binzhou 256600; 2.Animal Science and Veterinary Medicine Academy, Binzhou 256600)

The pathogen was isolated on a dead cattle from a farm in Shandong Dongying. The serotype O78 Escherichia coli was confirmed by morphological observation,biochemical test,PCR assay,drug sensitive test and animal infection experimen. Results showed that the isolates with multidrug-resistant had certain pathogenic to Kunming mice.

Bovine; Escherichia coli; Isolation; Identification

S858.23

A

1004-4264（2017）02-0026-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.02.007

2016-07-02

山東省現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-12-011-12)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2014CQ012）。

李天芝(1985-)，女，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)研究工作。