潘曉娟張 曉王進(jìn)山張光峰

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院東院普內(nèi)科，廣州510080)

結(jié)締組織病 (connective tissue disease，CTD)是一種主要侵犯全身結(jié)締組織和血管的自身免疫性疾病，常累及全身多個(gè)臟器系統(tǒng)，肺臟是易受累器官之一。CTD患者并發(fā)間質(zhì)性肺病 (interstitial lung disease，ILD)發(fā)病率高，治療效果差[1]，目前臨床尚無特效藥物，因此探討CTD相關(guān)ILD(CTD-ILD)的發(fā)病機(jī)制對(duì)臨床治療及藥物開發(fā)均有重要的指導(dǎo)意義。ILD致病機(jī)制復(fù)雜，以氧化與抗氧化體系失調(diào)、持續(xù)炎癥反應(yīng)、大量促炎及促纖維化因子蓄積為主要特點(diǎn)，常伴隨著過量膠原的產(chǎn)生及蓄積[2]。肺組織損傷后的氧化還原反應(yīng)及隨后的不協(xié)調(diào)組織修復(fù)機(jī)制是導(dǎo)致ILD發(fā)生和發(fā)展的主要機(jī)制。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 (NDAPH氧化酶，NOX)家族是參與組織損傷后氧化還原反應(yīng)的重要酶類。尼克酰胺腺嘌呤氧化酶4(nicotinamide adenine oxidase 4，NOX4)的主要氧化產(chǎn)物為H2O2，主要作為第二信使發(fā)揮作用，NOX4是否也參與CTD-ILD發(fā)病過程，目前尚不清楚。本研究擬應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法初步探討NOX4在CTD-ILD的表達(dá)規(guī)律。

對(duì)象與方法

對(duì)象

收集2001至2016年確診為CTD-ILD并行CT引導(dǎo)下細(xì)針穿刺肺活檢病理標(biāo)本，以本院不吸煙且無感染的肺癌患者癌旁正常肺組織作為對(duì)照組。CTD-ILD納入標(biāo)準(zhǔn):符合以下(1)＋(5)＋(2)～(4)中任意項(xiàng)。(1)符合各類結(jié)締組織病國際通用標(biāo)準(zhǔn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)有咳嗽、咳痰、胸悶、胸痛及氣促等呼吸道表現(xiàn)，排除阻塞性通氣障礙者；(3)肺功能:限制性通氣功能障礙、氣體彌散功能降低；(4)影像學(xué)改變:高分辨率CT檢查顯示磨玻璃樣、網(wǎng)格樣、蜂窩樣、纖維條索狀影及囊性變等；(5)肺組織活檢病理表現(xiàn):符合2002年美國胸科學(xué)會(huì)與歐洲呼吸學(xué)會(huì)(American Thoracic Society/European Respiratory Society，ATS/ERS)制訂的病理表現(xiàn)，并排除妊娠、感染、藥物、腫瘤及吸煙等因素。該研究得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)，且取得所有參與者的知情同意。

依照ATS/ERS分型標(biāo)準(zhǔn)[3]，對(duì)37例CTD-ILD患者進(jìn)行分型；病理表現(xiàn)為炎癥和纖維化并存，缺乏ATS/ERS各分型的特征表現(xiàn)，按照筆者以往方法暫定未定型[4]。

方法

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中NOX4的表達(dá):CTD-ILD 37例和對(duì)照組20例，石蠟包埋肺組織，按5μm厚度行石蠟切片。脫蠟至水后，用3%H2O2作用15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，1%Tilton X-100透化細(xì)胞膜10 min，兔抗人NOX4多克隆抗體(北京博奧森1∶200)，室溫孵育60 min，辣根酶標(biāo)記抗兔二抗 (基因科技有限公司，GK600705)室溫孵育30min，二氨基聯(lián)苯氨 (DAB)顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液代替一抗。

免疫組織化學(xué)評(píng)分方法:400倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野在同一參數(shù)下進(jìn)行拍照，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析，以平均光密度值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)標(biāo)本5張照片平均光密度值的均數(shù)作為本例標(biāo)本的最終光密度值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析:采用單樣本KS檢驗(yàn)判斷計(jì)量資料是否呈正態(tài)分布；非正態(tài)分布資料采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)，正態(tài)分布資料采用Studentt檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

共收集CTD-ILD患者37例，女性29例，男性8例，年齡21～72歲，平均 (47.4±2.2)歲，其中系統(tǒng)性硬化病6例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡5例，原發(fā)性干燥綜合征5例，多發(fā)性肌炎/皮肌炎10例，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎3例，血管炎4例，混合性結(jié)締組織病4例。37例CTD-ILD患者中確診為非特異性間質(zhì)性肺炎20例；普通型間質(zhì)性肺炎2例，剩余15例為未定型。選取20例不吸煙并無感染的肺癌患者癌旁正常肺組織作為對(duì)照組，其中女性12例，男性8例，年齡29～72歲，平均 (45.6±1.1)歲。試驗(yàn)組和對(duì)照組年齡及性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

NOX4在正常肺組織和CTD-ILD中均有表達(dá)，在正常肺組織中NOX4主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中存在散在的表達(dá)，染色強(qiáng)度多數(shù)呈中等強(qiáng)度；在CTD-ILD肺組織中，NOX4的表達(dá)范圍明顯增大，染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。NOX4除在肺泡上皮細(xì)胞中存在強(qiáng)表達(dá)之外，在肺成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞中也呈強(qiáng)陽性表達(dá)，NOX4不僅在細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá)，在部分細(xì)胞的細(xì)胞核中也呈強(qiáng)陽性表達(dá) (圖1)。

圖1 NOX4在CTD-ILD肺組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)A:女性，53歲，多發(fā)性皮肌炎并發(fā)間質(zhì)性肺病患者NOX4免疫組織化學(xué)染色；直柄空心箭頭所示為炎癥細(xì)胞，叉尾空心箭頭所示為成纖維細(xì)胞，無柄空心箭頭所示為肺泡上皮細(xì)胞 (×400)；B:肺癌患者癌旁正常肺組織NOX4免疫組織化學(xué)染色 (×400)Fig 1 Expression of NOX4 on the lung tissue of CTD-ILD and paracancerousA:female，53 years old，multiple dermatomyositis with interstitial lung disease；straight hollow arrows showed inflammatory cells，forked hollow arrows showed fibroblasts，sessile hollow arrows showed epithelial cells(×400)；B:NOX4 expression on paracancerous lung tissue obtained from a lung cancer patient(×400)

統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)37例CTD-ILD患者肺組織中NOX4的表達(dá)量較20例正常肺組織中的表達(dá)量明顯升高(57.77±5.62vs.20.26±5.23，P＜0.001)，CTD-ILD不同組織類型中NOX4的表達(dá)量分別為:系統(tǒng)性硬化癥60.80±16.42，系統(tǒng)性紅斑狼瘡59.54±18.50，原發(fā)性干燥綜合征68.76±31.01，多發(fā)性肌炎/皮肌炎57.14±9.33，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎49.42±17.34，血管炎57.12±16.36，混合型 CTD 55.49±17.06，NOX4 在各組間的表達(dá)量未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NOX4在不同病理類型中的表達(dá)量分別為:非特異性間質(zhì)性肺炎58.47±7.96，普通型間質(zhì)性肺炎 48.71±31.43，未定型58.06±8.69。因普通型例數(shù)太少，不宜行統(tǒng)計(jì)分析。另外在免疫組化玻片上很難將所有肺泡上皮細(xì)胞區(qū)分出來，所以本研究未分析NOX4在CTD-ILD和正常肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)差異。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)在CTD-ILD中NOX4的表達(dá)量明顯增高，此結(jié)果與Amara等[5]在特發(fā)性肺纖維化中的研究相一致，說明CTD-ILD與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病機(jī)制存在共同之處。CTD-ILD與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病機(jī)制不明，因?yàn)镃TD-ILD患者往往伴隨著更為嚴(yán)重的全身炎癥?，F(xiàn)普遍認(rèn)為，在肺組織的損傷及損傷修復(fù)過程中，促纖維化與抗纖維化體系的失衡是導(dǎo)致肺纖維化的主要原因。氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞受損的一個(gè)重要因素，活性氧是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的主要產(chǎn)物，生理狀態(tài)下，活性氧是維持體內(nèi)細(xì)胞功能及參與細(xì)胞增殖、分化的重要分子，但在病理狀態(tài)下，過度表達(dá)的活性氧不僅導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，同時(shí)也參與到多種信號(hào)分子的調(diào)節(jié)[6]?；钚匝踔饕獊碓从贜ADPH氧化酶。NOX家族由NADPH氧化酶中的主要催化基團(tuán)，NOX家族有NOX1～5以及DUOX1～2組成，在不同的組織結(jié)構(gòu)中及不同的細(xì)胞中，各成員的表達(dá)量及表達(dá)范圍各不相同。有研究發(fā)現(xiàn)，肺上皮細(xì)胞受損后，NOX4的表達(dá)量明顯增加，博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中NOX4的表達(dá)量明顯增加，特異性抑制NOX4的表達(dá)則明顯抑制小鼠肺纖維化的進(jìn)展[7]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)NOX4可能參與到肺上皮細(xì)胞損傷及隨后的修復(fù)過程[6，8]。因此NOX4在CTD相關(guān)的肺纖維化過程中可能在肺上皮細(xì)胞損傷及隨后的損傷修復(fù)過程中發(fā)揮一定的作用。

CTD以全身炎癥反應(yīng)及多系統(tǒng)、器官受累為主要特點(diǎn)，在肺纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中伴隨著炎癥損傷、修復(fù)過程，慢性炎癥反應(yīng)一度被認(rèn)為是肺纖維化的主要機(jī)制之一，然而近年研究發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞的過度增殖，過量膠原的產(chǎn)生和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，是導(dǎo)致肺纖維化的主要機(jī)制。肌成纖維細(xì)胞是肺纖維化過程的主要效應(yīng)細(xì)胞，在肺纖維化過程中主要有三個(gè)來源:成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factorα，TNF-α) 及血小板衍生生長因子等炎癥分子誘導(dǎo)下被原位激活，上皮細(xì)胞通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制轉(zhuǎn)化肌成纖維細(xì)胞，血循環(huán)系統(tǒng)中的纖維細(xì)胞通過依賴于CXCR-CXCL12機(jī)制潛入到內(nèi)皮下層并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[9-10]。由于氧化應(yīng)激與過度的炎癥反應(yīng)密不可分，因此NOX4可能參與成纖維細(xì)胞的激活。TGF-β通路能介導(dǎo)細(xì)胞趨化、增殖及分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成及黏附，并且能夠減少細(xì)胞外基質(zhì)降解等效應(yīng)，被認(rèn)為是肺纖維化過程最關(guān)鍵的細(xì)胞因子[11]，在TGF-β1介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化過程中，特異性干擾NOX4，則會(huì)干擾肌成纖維細(xì)胞的形成[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)NOX4在細(xì)胞中的表達(dá)部位，除在細(xì)胞質(zhì)中存在表達(dá)以外，在細(xì)胞核中也存在表達(dá)，NOX4的氧化應(yīng)激產(chǎn)物為H2O2，較超氧陰離子和羥自由基更為穩(wěn)定，更易作為細(xì)胞信使參與到細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中，細(xì)胞核是基因翻譯、轉(zhuǎn)錄主要部位，因此NOX4可能在基因翻譯與轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌細(xì)胞中，位于細(xì)胞核內(nèi)的NOX4通過所產(chǎn)生的活性氧干擾細(xì)胞核內(nèi)磷酸化與去磷酸的平衡，從而參與多種細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[14]。那么NOX4在成纖維細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中是否也發(fā)揮有相似作用，是值得進(jìn)一步研究的方向之一。由于納入研究的病例數(shù)較少，本研究并未將臨床治療轉(zhuǎn)歸結(jié)果納入分析中，還有待擴(kuò)大樣本量后做進(jìn)一步的研究。

綜上，NOX4可能通過直接氧化損傷導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞受損，也可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的形成，從而促進(jìn)ILD的發(fā)生和發(fā)展。如果特異性阻斷NOX4的表達(dá)，可能對(duì)CTD相關(guān)肺纖維化的進(jìn)展有抑制作用。由于時(shí)間及經(jīng)費(fèi)限制，本研究尚未開展細(xì)胞及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。上述結(jié)論還有待后續(xù)研究觀察和驗(yàn)證。

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