劉俊利+許能祥+董臣飛

摘要：為探索多花黑麥草葉蛋白提取及純化工藝，采用不同的料水比、pH值和絮凝溫度進(jìn)行多花黑麥草葉蛋白的提取和選用不同純化劑進(jìn)行葉蛋白純化研究，結(jié)果表明，使用酸性熱提法提取葉蛋白效果最好。最佳提取條件為pH值為4.0，70 ℃水浴加熱10 min，葉蛋白提取率、純蛋白含量均達(dá)到最大值，分別達(dá)46.17%和53.13%。多花黑麥草葉蛋白的最佳純化試劑為醇類(lèi)物質(zhì)，葉蛋白純度提高6%～7.5%，綜合考慮成本、安全等因素，推薦使用乙醇作為葉蛋白的純化劑。

關(guān)鍵詞：多花黑麥草；葉蛋白；提??；純化

中圖分類(lèi)號(hào)： S816.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0343-03

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，人均畜產(chǎn)品需求持續(xù)增長(zhǎng)，飼料糧的供給不足已經(jīng)成為當(dāng)前糧食安全的主要問(wèn)題之一[1-2]。我國(guó)畜牧生產(chǎn)和淡水養(yǎng)殖業(yè)蛋白質(zhì)飼料缺口很大，開(kāi)發(fā)并利用植物蛋白資源對(duì)緩解養(yǎng)殖業(yè)蛋白資源缺乏具有重要作用[3-6]。多花黑麥草（Lolium multiflorum）為我國(guó)長(zhǎng)江中下游及其以南地區(qū)的重要冷季牧草，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、耐濕等優(yōu)點(diǎn)，是飼養(yǎng)家畜及草食性魚(yú)類(lèi)的優(yōu)質(zhì)飼料，目前主要用作鮮飼和青貯，但由于多花黑麥草供草期集中，短時(shí)間內(nèi)供過(guò)于求的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，而利用多花黑麥草進(jìn)行深度開(kāi)發(fā)利用較少[7-10]。多花黑麥草粗蛋白含量高，利用多花黑麥草生產(chǎn)葉蛋白，對(duì)緩解我國(guó)蛋白飼料嚴(yán)重短缺有重要意義。本試驗(yàn)以初穗期多花黑麥草為試驗(yàn)材料，進(jìn)行葉蛋白的提取工藝優(yōu)化研究，并對(duì)葉蛋白的純化進(jìn)行了初步研究，以期為多花黑麥草葉蛋白的高效提取及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合種養(yǎng)偱環(huán)基地初穗期的多花黑麥草，多花黑麥草品種為長(zhǎng)江2號(hào)。

1.2 多花黑麥草葉蛋白提取

1.2.1 原料前處理

稱(chēng)取多花黑麥草整株100 g，清洗，剪成長(zhǎng)1～2 cm的小段，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的料水比加入規(guī)定量的水，打漿機(jī)打漿后，用3層紗布過(guò)濾，收集濾液，濾渣用蒸餾水洗滌2次，棄濾渣后得到的濾液即為含有多花黑麥草葉蛋白的汁液。

1.2.2 調(diào)pH值 使用HCl調(diào)節(jié)多花黑麥草汁液的pH值至設(shè)定的pH值。

1.2.3 加熱 采用恒溫水浴加熱的方法將多花黑麥草汁液加熱到設(shè)定的溫度，在水浴鍋內(nèi)恒溫一定的時(shí)間得到絮凝物。

1.2.4 冷卻離心 冷卻到室溫后裝入離心管內(nèi)，8 000 r/min離心7 min，去上清得到多花黑麥草葉蛋白濃縮物。

1.2.5 干燥 采用55 ℃恒溫干燥法對(duì)多花黑麥草葉蛋白濃縮物進(jìn)行干燥，烘干24 h至恒質(zhì)量。

1.3 多花黑麥草葉蛋白提取工藝的優(yōu)化

1.3.1 料水比對(duì)葉蛋白提取的影響 稱(chēng)取新鮮多花黑麥草3份，按鮮葉與水的重量比例1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4（g ∶mL）分別加水，打漿、過(guò)濾，將pH值調(diào)到4，70 ℃加熱10 min，重復(fù)3次。

1.3.2 pH值對(duì)葉蛋白提取的影響 稱(chēng)取新鮮多花黑麥草5份，按料水比1 g ∶3 mL加水，打漿、過(guò)濾，分別將pH值調(diào)到2、4、6、8、10，70 ℃加熱10 min，重復(fù)3次。

1.3.3 絮凝溫度對(duì)葉蛋白提取的影響 稱(chēng)取新鮮多花黑麥草4份，按料水比1 g ∶3 mL加水，打漿、過(guò)濾，將pH值調(diào)到4，分別在40、50、60、70、80 ℃下加熱10 min，重復(fù)3次。

1.3.4 絮凝時(shí)間對(duì)葉蛋白提取的影響 稱(chēng)取新鮮多花黑麥草4份，按料水比1 g ∶3 mL加水，打漿、過(guò)濾，將pH值調(diào)到4，70 ℃ 分別加熱5、10、15、20 min，重復(fù)3次。

1.3.5 提取工藝的優(yōu)化 選取料水比、pH值、絮凝溫度3個(gè)因素，設(shè)計(jì)3個(gè)水平正交試驗(yàn)因子的水平表（表1），按照標(biāo)準(zhǔn)正交表L9（33）進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 葉蛋白純化

分別使用甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、四氯化碳、異丙醇、蒸餾水等試劑以料水比1 g ∶3 mL浸洗新鮮提取的葉蛋白粗提物，靜置12 h，3 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀烘干后測(cè)定其純化蛋白質(zhì)含量。重復(fù)3次。

1.5 計(jì)算方法

葉蛋白得率=葉蛋白干質(zhì)量多花黑麥草樣品鮮質(zhì)量×100%；

葉蛋白提取率=葉蛋白干質(zhì)量×粗蛋白含量鮮樣烘干后干基質(zhì)量×干基蛋白含量×100%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA程序進(jìn)行Duncans多重比較分析，不同指標(biāo)的平均值通過(guò)SAS 9.2 軟件采用Fishers LSD法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多花黑麥草葉蛋白提取工藝的研究

2.1.1 料水比對(duì)葉蛋白提取的影響 不同料水比提取葉蛋白的試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，隨著料水比的提高，提取物中蛋白質(zhì)的含量也逐漸增高，當(dāng)料水比為1 g ∶3 mL時(shí)，蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，之后呈降低趨勢(shì)；而葉蛋白提取率和蛋白質(zhì)的含量呈相關(guān)關(guān)系，在料水比為1 g ∶3 mL時(shí)，葉蛋白的提取率最高，為45.39%，顯著高于料水比為1 g ∶4 mL的提取率（41.77%），但料水比為1 g ∶2 mL和1 g ∶3 mL的葉蛋白提取率差異不顯著。

2.1.2 pH值對(duì)葉蛋白提取的影響

不同的pH值條件下，蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率差異均達(dá)到顯著和極顯著水平。當(dāng)pH值從2增加到4時(shí)，蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率均達(dá)到最高，分別為52.08%和45.95%，顯著高于pH值為2時(shí)的46.82%和39.92%；當(dāng)pH值逐漸增大，溶液由酸性變?yōu)橹行灾翂A性時(shí)，蛋白沉淀量與提取率迅速下降，堿性越大，蛋白含量與提取率越低（表3）。

2.1.3 絮凝溫度對(duì)葉蛋白提取的影響

絮凝溫度升到 50 ℃，多花黑麥草中葉蛋白開(kāi)始絮凝沉淀，蛋白沉淀量隨著溫度的升高而逐漸增加，并最終趨于平穩(wěn)（表4）。由表4可見(jiàn)，當(dāng)溫度由60 ℃升到70 ℃時(shí)，多花黑麥草蛋白質(zhì)含量逐漸增大，從70 ℃升到80 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)含量下降，可見(jiàn)由60 ℃到80 ℃，蛋白質(zhì)含量先增大后降低，70 ℃時(shí)的蛋白質(zhì)含量（52.39%）顯著高于其他溫度；而從葉蛋白提取率來(lái)看，隨著溫度的逐漸升高，提取率一直呈增加狀態(tài)，但增加速度逐漸趨于平緩。綜上可知，70 ℃是提取葉蛋白的最佳絮凝溫度。

2.1.4 絮凝時(shí)間對(duì)葉蛋白提取的影響

在料水比 1 g ∶3 mL，pH值為4，70 ℃的絮凝溫度下，將多花黑麥草汁液分別加熱不等的時(shí)間。由表5可以看出，絮凝時(shí)間對(duì)多花黑麥草葉蛋白提取的影響較小。加熱5 min與加熱10 min蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率都較高，相比之下加熱10 min效果更好，提取率（45.97%）最高。

2.1.5 多花黑麥草葉蛋白提取工藝的優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果（表6）顯示，各因素對(duì)蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率都有顯著影響。按照極差R的大小，影響多花黑麥草中蛋白質(zhì)含量因素的大小順序?yàn)镃>B>A，即絮凝溫度>pH值>料水比；影響多花黑麥草中葉蛋白提取率因素的大小順序?yàn)锽>A>C，即pH值>料水比>絮凝溫度。表中計(jì)算分析后的最佳組合條件為A2B2C3，在料水比為1 g ∶3 mL、pH值為4、絮凝溫度 70 ℃ 的條件下，蛋白質(zhì)含量53.13%，葉蛋白提取率 46.17%，2項(xiàng)指標(biāo)均為最高值。

2.2 多花黑麥草葉蛋白的純化

分別用甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、四氯化碳、異丙醇、蒸餾水等試劑對(duì)新鮮提取的多花黑麥草葉蛋白粗提物進(jìn)行萃取純化。試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，當(dāng)未使用純化劑時(shí)，對(duì)照組中多花黑麥草葉蛋白的蛋白純度在56%左右；使用純化劑后，在各種純化劑作用下葉蛋白的蛋白純度均有所上升，影響大小依次為丙酮>乙醇 >甲醇>異丙醇>四氯化碳>水。其中丙酮的純化效果最好，蛋白質(zhì)純度達(dá)到67%；乙醇次之，為64%；水的效果最差，僅為57%，而甲醇、異丙酮及四氯化碳之間差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 多花黑麥草葉蛋白提取工藝

試驗(yàn)中，當(dāng)料水比達(dá)到1 g ∶3 mL、pH值為4、絮凝溫度為 70 ℃、絮凝時(shí)間為10 min時(shí)，提取物中蛋白質(zhì)含量最高為 53.13%，且葉蛋白提取率也最高，為46.17%。從料水比來(lái)看，打漿過(guò)程中，加水量太少，使得多花黑麥草鮮樣浸泡不充分，打漿不徹底，葉蛋白不能充分提??；隨著加水量增多，雖然樣品中葉蛋白得到充分浸泡與提取，但是同樣會(huì)溶解較多的細(xì)小纖維與色素，加熱過(guò)程中蛋白不能完全絮凝沉淀，仍溶解在濾液中，造成提取率下降。

蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處環(huán)境pH值發(fā)生改變時(shí)，其表面的電荷量會(huì)隨著溶液pH值的改變而發(fā)生相應(yīng)的變化。在多花黑麥草葉蛋白提取過(guò)程中，提取液pH值為4時(shí)蛋白絮凝沉淀量最大且葉蛋白提取率最高，表明多花黑麥草葉蛋白呈酸性。

溫度是影響蛋白質(zhì)含量的重要因素。絮凝溫度在50～80 ℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，多花黑麥草葉蛋白的提取率也隨之增加，并逐漸緩和，因?yàn)槿~蛋白不但受加熱變性的影響，同時(shí)還要受等電點(diǎn)沉淀因素的作用，蛋白凝聚機(jī)會(huì)和敏感性得以增加，從而使葉蛋白凝聚速度加快，絮凝出的物質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密且易分離，保證了葉蛋白的高提取率。隨著絮凝時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率變化相差不大，并不隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這說(shuō)明絮凝時(shí)間并不是影響多花黑麥草葉蛋白提取的主要因素。

從選取影響葉蛋白提取的衡量指標(biāo)來(lái)看，大部分類(lèi)似的試驗(yàn)主要考慮葉蛋白得率，但是由于葉蛋白中粗蛋白含量會(huì)隨著試驗(yàn)參數(shù)的改變而發(fā)生較大的變化，所以蛋白質(zhì)含量這一指標(biāo)不能準(zhǔn)確且全面地反映從多花黑麥草中提取的蛋白質(zhì)情況，同理，葉蛋白得率也是如此，為彌補(bǔ)此項(xiàng)不足，通過(guò)增加葉蛋白提取率來(lái)補(bǔ)充反映蛋白質(zhì)的提取情況。本試驗(yàn)在多花黑麥草葉蛋白提取工藝的優(yōu)化中，綜合考慮蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率2項(xiàng)指標(biāo)的結(jié)果，同時(shí)兼顧生產(chǎn)成本及絮凝時(shí)間，選擇料水比1 g ∶3 mL、pH值4、絮凝溫度70 ℃、絮凝時(shí)間 10 min 為最佳試驗(yàn)條件，在該條件下，蛋白質(zhì)含量與葉蛋白提取率均可達(dá)到最高值，該結(jié)果與楊朝英等報(bào)道的試驗(yàn)結(jié)果[11]相一致。

3.2 多花黑麥草葉蛋白的純化

鮮樣中提取的多花黑麥草葉蛋白，由于其中含有多種植物色素如葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素，類(lèi)脂化合物以及能夠?qū)е虏涣細(xì)馕都邦伾亩喾宇?lèi)物質(zhì)，對(duì)其利用有不利影響，而通過(guò)使用有機(jī)溶劑進(jìn)行純化，不但除去了這些不良物質(zhì)，還提高了葉蛋白的純度[12-13]。本試驗(yàn)通過(guò)使用各種有機(jī)溶劑，提高葉蛋白純度百分點(diǎn)左右，純化后的多花黑麥草葉蛋白顏色變淺，無(wú)異味，蛋白質(zhì)含量明顯升高。而采用水進(jìn)行純化效果最差，因?yàn)槿~綠素類(lèi)物質(zhì)不溶于水中；采用丙酮的純化效果最好，但是丙酮具有強(qiáng)的刺激性，且易燃易爆，因此，不推薦丙酮作為純化劑大量使用；醇類(lèi)效果也較好，其中乙醇作為純化劑，不但可除去植物色素、類(lèi)脂化合物及多酚類(lèi)化合物，而且其成本較低、對(duì)人體無(wú)毒、易于回收，因此，推薦使用乙醇作為葉蛋白的純化劑。

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