馬景蕃++寇宗娟++劉喜明++鐘麗娟++吳程

摘要：利用超聲波法提取不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）中抗氧化活性物質(zhì)，以抗氧化活性為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法研究超聲功率、超聲時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對產(chǎn)物抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，在超聲功率317 W、超聲時間60 min、料液比1∶20（m∶V）、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%的條件下，產(chǎn)物抗氧化活性即Trolox濃度為59 076.4 μmol/L。產(chǎn)物對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子都具有清除作用，其IC50值分別為0.45、1.03、0.59 mg/mL。

關(guān)鍵詞：不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）；超聲波提??；抗氧化

中圖分類號：S634.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0526-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.034

Optimization of Extraction of Bioactive Components from Non-heading Chinese Cabbage and Its Antioxidant Activity

MA Jing-fan1， KOU Zong-juan1， LIU Xi-ming2， ZHONG Li-juan1， WU Cheng1

（1.School of Life Sciences， Longyan University， Longyan 364012， Fujian，China；2.School of Art Design， Longyan University，

Longyan 364012， Fujian，China）

Abstract： Antioxidant substances was extracted from non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris ssp. chinensis Makino） in supersonic method. Regard the antioxidant activity as an index， the effects of supersonic power， supersonic time， solid-liquid ratio and ethanol concentration on the antioxidant activity were studied by the response surface analysis. The results showed that under the conditions of 317 W supersonic power， 60 min supersonic time， 1∶20（m∶V） solid-liquid ratio and 70% ethanol concentration，the concentration of Trolox was 59 076.4 μmol/L. Products had scavenging action to DPPH radical， hydroxyl radical， and superoxide anion. IC50 were 0.45 mg/mL， 1.03 mg/mL， and 0.59 mg/mL， respectively.

Key words： non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）； supersonic extraction； antioxidant activity

不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）是長江中下游地區(qū)主栽蔬菜品種之一[1]，中醫(yī)認(rèn)為不結(jié)球白菜微寒味甘，有養(yǎng)胃生津、除煩解渴、利尿通便、清熱解毒的功效[2]。民間素有用帶根不結(jié)球白菜120 g，加生姜、蔥白各10 g，煨湯防治感冒與咳嗽[3]。近20多年來，國內(nèi)外學(xué)者從不結(jié)球白菜中分離得到一系列復(fù)雜的化學(xué)成分，其中相當(dāng)一部分具有生理活性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，不結(jié)球白菜提取物抗氧化的效果好，尤以未完全成熟，葉形舒展的嫩株抗氧化效果尤佳[5]。在防癌食品排行榜中，不結(jié)球白菜排在大蒜后面，名列第二[6]。最新研究還發(fā)現(xiàn)，不結(jié)球白菜提取物能提升血液中雌激素代謝物-2羥雌酮的水平，對預(yù)防乳腺癌有益[7]。這說明不結(jié)球白菜不但可作為一種食品，同時又具有保健作用和藥用價值。

響應(yīng)面分析法（Response Surface Method，RSM）是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法[8]。以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，確定各因素及其交互作用對各指標(biāo)的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，越來越多地應(yīng)用于各種生物化工處理過程。本研究采用RSM法優(yōu)化了不結(jié)球白菜活性物質(zhì)的提取工藝，并對其抗氧化活性進行了評價，為不結(jié)球白菜的綜合利用及產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

不結(jié)球白菜蘇州青由龍巖學(xué)院生物技術(shù)課題組提供。采收后，用聚乙烯膜真空包裝，迅速用液氮冷凍，真空冷凍干燥后粉碎過100目篩。

1.2 方法

1.2.1 DPPH自由基清除 稱取12.012 mg的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水定容至200 mL。利用超聲波將Trolox標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解，得到濃度為240 μmol/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入去離子水稀釋后分別得到濃度為40、80、120、160、200 μmol/L 的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將質(zhì)量為10 mg的 DPPH用甲醇定容至100 mL，將其稀釋后得到濃度為20 mg/L的DPPH甲醇溶液。吸取10 μL的Trolox水溶液，加入990 μL的DPPH甲醇溶液，定容至4 mL，混合均勻，暗處避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度。根據(jù)試驗結(jié)果，使用EXCEL軟件的線性擬合功能繪制DPPH自由基清除Trolox的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到線性回歸方程[9]。

1.2.2 提取不結(jié)球白菜抗氧化活性物質(zhì)的單因素試驗

1）料液比。準(zhǔn)確稱取5.0 g不結(jié)球白菜粉，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，功率 400 W，提取時間40 min的條件下，分別考察1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30及1∶35（m∶V，下同）的料液比對不結(jié)球白菜抗氧化活性物質(zhì)提取的影響。

2）超聲時間。準(zhǔn)確稱取5.0 g不結(jié)球白菜粉，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，功率400 W，料液比1∶20，考察30、40、50、60、70、80 min的不同超聲時間對不結(jié)球白菜抗氧化活性物質(zhì)提取的影響。

3）乙醇體積分?jǐn)?shù)。準(zhǔn)確稱取5.0 g不結(jié)球白菜粉，功率400 W，料液比1∶20，超聲時間60 min，考察40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇對不結(jié)球白菜抗氧化活性物質(zhì)提取的影響。

4）超聲波功率。準(zhǔn)確稱取5.0 g不結(jié)球白菜粉，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲時間60 min，料液比1∶20，考察100、200、300、400、500、600 W的超聲功率對不結(jié)球白菜抗氧化活性物質(zhì)提取的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D），利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken功能，以Trolox濃度為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面法優(yōu)化不結(jié)球白菜抗氧化活性物質(zhì)的提取條件，各因素和水平設(shè)計見表1。

1.2.4 不結(jié)球白菜活性物質(zhì)的抗氧化性 DPPH自由基清除率的測定采用DPPH 95%乙醇體系法[10]；羥自由基清除率的測定采用二價鐵離子測定法[11]；超氧陰離子自由基清除率的測定采用光照核黃素測定法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

回歸方程為Y=-0.000 5X+0.701，R2=0.998 3，表明Trolox濃度在0～1 000 μmol/L范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗結(jié)果

由圖1a可知，當(dāng)料液比從1∶10到1∶20變化時，Trolox濃度顯著增大（P<0.05），這時隨著有機溶劑的量逐漸增多，促使越來越多的不結(jié)球白菜活性成分溶于其中[13]，但當(dāng)料液比從1∶20到1∶35時， Trolox濃度變化不明顯（P>0.05），這可能是因為當(dāng)有機溶劑增加到一定程度時，不結(jié)球白菜中的活性物質(zhì)大多已經(jīng)溶解出來，再繼續(xù)增加有機溶劑的含量對提取影響不大[14]，故料液比采用1∶20。

由圖1b可知，當(dāng)超聲時間從30 min到60 min時，Trolox濃度呈顯著上升趨勢（P<0.05），說明隨著超聲時間的延長，超聲波作用對不結(jié)球白菜細胞壁的效果增強，使其破碎更為徹底，其中的活性成分更容易被有機溶劑溶出。但當(dāng)超聲時間從60 min延長到80 min時，Trolox濃度上升幅度減小，且相鄰兩處理間差異不顯著（P>0.05），這可能是不結(jié)球白菜活性成分的溶出已達到飽和。因此，超聲波的最佳提取時間控制在60 min為宜。

從圖1c可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加，Trolox濃度呈顯著增加的趨勢（P<0.05），當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，Trolox濃度最大；這說明較高體積分?jǐn)?shù)的乙醇有利于不結(jié)球白菜活性成分的溶出。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時，Trolox濃度呈下降趨勢（P>0.05），這說明不結(jié)球白菜活性成分的溶出隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加沒有明顯的正相關(guān)關(guān)系。因此，可以得出最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

從圖1d可以看出，當(dāng)超聲功率從100 W增加到300 W的過程中，Trolox濃度顯著增大（P<0.05），當(dāng)超聲功率達到300 W時，Trolox濃度達到最大值，但當(dāng)超聲功率從300 W繼續(xù)增加到600 W時，Trolox濃度反而有所下降，可能是由于當(dāng)超聲功率增大到一定程度時，其對不結(jié)球白菜細胞壁的破碎程度達到最大，再繼續(xù)增強超聲功率就不會對Trolox濃度造成太大影響。因此，可以得出最佳超聲功率為300 W。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化不結(jié)球白菜活性物質(zhì)提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化不結(jié)球白菜活性物質(zhì)的提取工藝，其設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸分析[15]，得到Trolox濃度（Y）對因素A、B、C及D相應(yīng)的二次方程模型：Y= 58 722.24 + 4 002.42A - 70.84B - 613.13C + 779.54D-203.45AB + 859.65AC - 573.10AD - 628.58BC-397.45 BD+388.23CD - 5 834.77A2 - 3 024.73B2 - 2 423.97C2 - 3 292.86D2。同時對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，其結(jié)果見表3。

從表3中可以看出，回歸模型達到極顯著水平（P<0.01），說明模型預(yù)測值和實際值非常吻合，模型可靠。失擬項P>0.05，說明未知因素對試驗結(jié)果影響較小。回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.990 0，顯示響應(yīng)值的變化99.00%來源于超聲功率（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、和乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）4個變量。因此，回歸方程具有較高的擬合度和可信度，說明回歸方程與實際情況吻合較好，可用以推測真實試驗的提取效果。其中，一次項A、C、D及二次項A2、B2、C2、D2對Trolox濃度的影響極顯著。對回歸方程中一次項系數(shù)的絕對值進行比較，可判斷因子影響的主次性，結(jié)合方差分析結(jié)果，確定對Trolox濃度的影響從大到小的順序依次為超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間。

2.3.2 各因子交互作用對Trolox濃度的影響 在其他因素為零的水平上，利用軟件選擇超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間4個變量中的2個交互因素對Trolox濃度的影響進行分析，回歸優(yōu)化得到相應(yīng)的響應(yīng)面及等高線圖，其中顯著交互項的響應(yīng)曲面見圖2。由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，Trolox濃度隨超聲功率和料液比的增大而增大，在交互作用等高線中，等高線沿A軸方向變化相對密集，說明超聲功率對響應(yīng)值峰值的影響大于料液比，這與回歸分析結(jié)果相同。

2.3.3 最佳提取工藝及驗證 結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，不結(jié)球白菜活性物質(zhì)的最佳提取工藝為超聲功率316.73 W、超聲時間59.89 min、料液比 1∶19.71、乙醇體積分?jǐn)?shù)70.43%，此條件下Trolox濃度的預(yù)測值為59 444.7 μmol/L。考慮到實際操作的便利，將不結(jié)球白菜活性物質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)調(diào)整為超聲功率317 W、超聲時間60 min、料液比 1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，此條件下Trolox濃度的理論值為59 445.1 μmol/L。以最佳提取工藝條件，重復(fù)3次試驗，得到Trolox濃度值為59 076.4 μmol/L。兩者相比，相對誤差約為0.62%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.4 不結(jié)球白菜提取物的抗氧化活性測定

2.4.1 提取物對DPPH自由基清除率的測定 根據(jù)響應(yīng)面法最佳提取工藝制備不結(jié)球白菜的活性提取物，稱取提取物干燥粉末，用去離子水分別配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液，測定DPPH自由基清除率，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著不結(jié)球白菜提取物濃度的增大，對DPPH自由基的清除率也逐漸增大，當(dāng)提取物的濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基清除率達到91%，IC50為0.45 mg/mL。

2.4.2 提取物對羥自由基清除率的測定 稱取最佳提取工藝下制備的不結(jié)球白菜活性提取物干燥粉末，用去離子水分別配成1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL的溶液，測定其對羥自由基的清除率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著不結(jié)球白菜提取物濃度的增大，對羥自由基的清除率也隨之增大，當(dāng)提取物的濃度為1.8 mg/mL時，羥自由基清除率達到了77%，IC50值為1.03 mg/mL。

2.4.3 提取物對超氧陰離子清除率的測定 稱取最佳提取工藝下制備的不結(jié)球白菜活性提取物干燥粉末，用水分別配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液，測定提取物對超氧陰離子的清除率，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著提取物濃度的增大，對超氧陰離子的清除率也逐漸增大，當(dāng)不結(jié)球白菜提取物的濃度為1.0 mg/mL時，超氧陰離子清除率為76%，IC50值為0.59 mg/mL。

3 小結(jié)

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面法優(yōu)化不結(jié)球白菜活性物質(zhì)的超聲波提取條件。結(jié)果表明，超聲功率、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對Trolox濃度的影響顯著，超聲功率與料液比交互作用對Trolox濃度影響顯著。對Trolox濃度的影響從大到小的順序依次為超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間。優(yōu)化后不結(jié)球白菜活性物質(zhì)的最佳提取工藝為超聲功率317 W、超聲時間60 min、料液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，此條件下Trolox濃度值為59 076.4 μmol/L，與預(yù)測值的相對誤差為0.62%。

自由基是機體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，能夠損害機體的細胞和組織，甚至引起衰老效應(yīng)或者慢性疾病，本試驗對最佳提取工藝下制備的不結(jié)球白菜活性提取物進行了抗氧化研究，其對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子都表現(xiàn)出較好的清除能力，IC50值分別為0.45、1.03、0.59 mg/mL。在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著活性提取物濃度的增加，其清除自由基的活性增大。本研究為不結(jié)球白菜在醫(yī)藥和保健等方面的深入研究和應(yīng)用提供參考和依據(jù)，而對于不結(jié)球白菜抗氧化活性成分的分離純化還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 侯喜林.不結(jié)球白菜育種研究新進展[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2003，26（4）：111-115.

[2] 王述彬，袁希漢，蘇小俊，等.中國不結(jié)球白菜種質(zhì)資源對蕪菁花葉病毒的抗病性鑒定[J].中國蔬菜，2002（1）：11-13.

[3] 郝慧楠，工 倩，侯喜林，等.不結(jié)球白菜主要農(nóng)藝性狀的分離分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，33（4）：8-12.

[4] MA J F，HOU X L，XIAO D，et al. Cloning and characterization of the BcTuR3 gene related to resistance to Turnip Mosaic Virus（TuMV） from non-heading Chinese cabbage[J]. Plant Mol Biol Rep，2010，28：588-596.

[5] ROJO E，SOLANO R，SANCHEZ-SERRANO J J. Interactions between signaling compounds involved in plant defense[J]. J Plant Growth Regul，2003，22：82-98.

[6] JONATHAN D G J，JEFFERY L D. The plant immune system[J]. Nature，2006，444：323-329.

[7] LIU T K，LI Y，ZHANG C W，et al. Basic helix-loop-helix transcription factor BcbHLHpol functions as a positive regulator of pollen development in non-heading Chinese cabbage[J]. Funct Integr Genomics，2014，14：731-739.

[8] 王 希，鐘耀廣，市川壽.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波快速提取鰭魚皮中膠原蛋白的工藝研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，45（7）：117-123.

[9] DYRBY M，WCSTERGAARD N，STAPCLFCLDT H. Light and heat sensitivity of red cabbage extract in soft drink model system[J]. Food Chemistry，2001，72（4）：431-437.

[10] GHAFOOR K，CHOI Y H，JCON J Y，et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds， antioxidant， and anthocyanins from grape（vitis vinifera） seed[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（11）： 4988-4994.

[11] AMESEN J A，GILDBERG A. Extraction and characterisation of gelatine from Atlantic salmon（Salma salar） skin[J]. Bioresource Technology，2007，98（1）：53-57.

[12] VASUDEVA N，SHARMA S K. Biologically active compounds from the genus hibiscus[J].Pharmaceutical Biology，2008，46（3）：145-153.

[13] HUANG W，XUE A，NIU H，et al. Optimised ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Folium eucommiae and evaluation of antioxidant activity in multi-test systems in vitro[J]. Food Chemistry，2009，114（3）：1147-1154.

[14] HOU D X，TONG X H，TERAHARA N，et al. Delphinidin 3-sambubioside， a hibiscus anthocyanin， induces apoptosis in human leukemia cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2005，440（1）：101-109.

[15] CHO S M，GU Y S，KIM S B. Extracting optimization and physical properties of yellowfin tuna （Thunnus albacares） skin gelatin compared to mammalian gelatins[J]. Food Hydrocolloids，2005，19：221-229.