樂易林+倪黎+郭星星

摘要：微生物利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是可再生能源發(fā)展策略之一。人們對常溫菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的代謝途徑和機(jī)理進(jìn)行了廣泛深入的研究。目前天然高效發(fā)酵產(chǎn)乙醇菌不能利用五碳糖，因為能利用五碳糖的常溫菌乙醇產(chǎn)率低。隨著產(chǎn)乙醇嗜熱微生物的深入研究，嗜熱菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的發(fā)展為研究帶來了契機(jī)。文中綜述了發(fā)酵產(chǎn)乙醇嗜熱菌的種類、代謝途徑及其關(guān)鍵酶功能特性的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素；乙醇；嗜熱菌；代謝途徑；五碳糖

中圖分類號：S216.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0022-04

我國農(nóng)業(yè)每年產(chǎn)生大量秸稈，這些生物質(zhì)如能得到開發(fā)利用，可以滿足人類對能源的需求。木質(zhì)纖維原料的開發(fā)利用是現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域研究熱點之一。木質(zhì)纖維水解產(chǎn)生的五碳糖和六碳糖通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是可再生能源發(fā)展策略之一。以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和運動發(fā)酵單孢菌（Zymomonas mobilis）為代表的乙醇代謝途徑是通過丙酮酸脫羧酶（PDC）和乙醇脫氫酶（Adh）將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醇，即所謂的雙酶法[1]。酵母菌和運動發(fā)酵單胞菌能將六碳糖轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳，酵母菌和運動發(fā)酵單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的缺點是都不能代謝五碳糖產(chǎn)乙醇。針對酵母菌和運動發(fā)酵單胞菌不能利用五碳糖發(fā)酵乙醇的問題，將釀酒酵母或運動發(fā)酵單胞菌來源的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因在能夠高效代謝五碳糖的微生物中共表達(dá)，代謝五碳糖的微生物經(jīng)過代謝工程改造從而獲得發(fā)酵乙醇能力；也可以將五碳糖代謝途徑在釀酒酵母和運動發(fā)酵單胞菌中表達(dá)，使代謝途徑改造后的釀酒酵母和運動發(fā)酵單胞菌能夠利用五碳糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇[2-3]。

微生物中另外一條乙醇代謝途徑是通過丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶（POR）或丙酮酸甲酸裂解酶（PFL），將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，再通過輔酶A-依賴型的乙醛脫氫酶（AdhE）轉(zhuǎn)化為乙醛，最后在乙醇脫氫酶作用下生成乙醇，即所謂的三酶法。大腸桿菌雖然有完整的己糖和戊糖代謝途徑，但用葡萄糖或木糖等進(jìn)行發(fā)酵時，產(chǎn)物中乙醇只占很小的一部分，大部分為乳酸、甲酸、琥珀酸和醋酸等[4]。對產(chǎn)乙醇重組大腸桿菌的研究和探索進(jìn)行了大量工作，將大腸桿菌代謝途徑中的一些基因敲除，通過代謝工程改造獲得具有乙醇生產(chǎn)能力較強(qiáng)的工程菌株[4]。

自20世紀(jì)80年代初，國外開始提出利用嗜熱菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[5]。嗜熱菌利用底物范圍比較廣，即能夠利用纖維素、半纖維素和淀粉，也可以利用木糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖等發(fā)酵生產(chǎn)生物能源[6-9]。嗜熱菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的優(yōu)勢是能夠同步進(jìn)行原料的生物降解、乙醇發(fā)酵和產(chǎn)物分離。本文主要總結(jié)了嗜熱菌乙醇代謝途徑及其關(guān)鍵酶。

1 分離鑒定的產(chǎn)乙醇嗜熱菌

至今人們已經(jīng)從多種環(huán)境中分離到產(chǎn)乙醇嗜熱菌，主要有來源于梭菌屬的熱解糖梭菌（Clostridium thermosaccharolyticum）、熱纖梭菌（C. thermocellum），熱厭氧桿菌屬的解糖嗜熱厭氧芽孢桿菌（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）、嗜熱厭氧芽孢桿菌AK17（Thermoanaerobacterium AK17），來源極端嗜熱菌的嗜熱厭氧乙醇桿菌JW200（T. ethanolicus JW200），馬瑞氏嗜熱厭氧桿菌（T. mathranii）以及來源于超嗜熱菌的激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）、海棲熱袍菌（Thermococcus paralvinellae）、新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana）（表1）[6-20]。雖然嗜熱菌具有利用多種底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的能力，但是目前嗜熱菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的濃度還很低，產(chǎn)物中除了乙醇，還伴有乳酸、乙酸、二氧化碳等。對嗜熱菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的代謝調(diào)控機(jī)理是人們研究的熱點。

2 嗜熱菌乙醇代謝途徑研究進(jìn)展

嗜熱微生物根據(jù)最適生長溫度可以分成3類：最適生長溫度在50～64 ℃的中溫嗜熱菌（moderate thermophiles）、最適生長溫度在65～79 ℃的極端嗜熱菌（extreme thermophiles）以及最適生長溫度超過80 ℃的超嗜熱菌（hyperthermophiles）[21]。

2.1 中溫菌乙醇代謝途徑

中溫厭氧芽孢桿菌主要利用糖酵解途徑（EMP）代謝葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸出路：一是直接被乳酸脫氫酶還原生成乳酸；一是生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A先后催化生成乙酸，或者乙酰輔酶A經(jīng)乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶先后催化生成乙醇。一般高溫菌的發(fā)酵途徑大多為混合酸發(fā)酵途徑，產(chǎn)物中除了乙醇，它們會產(chǎn)生乳酸、乙酸，有的還會產(chǎn)生二氧化碳、氫氣等[6-8]。中溫菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇面臨的問題有：伴有乳酸和乙酸等副產(chǎn)物，有機(jī)酸的積累對細(xì)菌的生長具有很強(qiáng)的抑制作用，同時乙醇產(chǎn)率和乙醇耐受性低。

最近分離到的1株高溫厭氧芽孢桿菌發(fā)酵甘露醇產(chǎn)乙醇的初期，伴隨著微量的乙酸產(chǎn)生，隨后乙酸又立即被消耗。通過添加外源乙酸，發(fā)現(xiàn)高溫厭氧芽孢桿菌的乙醇產(chǎn)量獲得提高，推測RX1可能存在將乙酸轉(zhuǎn)化為乙醇的代謝途徑，目前對該菌的乙醇代謝途徑還在研究中[10]。

2.2 極端嗜熱菌乙醇代謝途徑

極端嗜熱菌如嗜熱厭氧乙醇桿菌JW200最適生長溫度為69 ℃，可以利用五碳糖、六碳糖、乳糖、蔗糖、纖維二糖、淀粉等發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[11]。嗜熱厭氧乙醇桿菌JW200發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時，當(dāng)乙醇濃度超過1%，乙醇發(fā)酵受到反饋抑制，產(chǎn)物從乙醇轉(zhuǎn)向乙酸和乳酸。嗜熱厭氧乙醇桿菌乙醇代謝受到嚴(yán)格的調(diào)控，人們對嗜熱厭氧乙醇桿菌中的醛脫氫酶和醇脫氫酶的功能特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，至2000年先后純化了2種醇脫氫酶（AdhA和AdhB），并克隆了相應(yīng)的基因AdhA和AdhB，酶學(xué)特性表明AdhB具有醛/醇脫氫酶雙功能活性，起初人們認(rèn)為AdhB是嗜熱厭氧乙醇桿菌乙醇代謝的關(guān)鍵酶[22-23]。2008 年，從嗜熱厭氧乙醇桿菌JW200中純化到了醛脫氫酶（AdhE），AdhE具有醛/醇脫氫酶雙功能[24]。隨后AdhE基因也被克隆，在嗜熱乙醇桿菌乙醇轉(zhuǎn)化途徑中存在2個雙功能的醛/醇脫氫酶AdhB和AdhE以及一個醇脫氫酶AdhA。研究表明，在模擬的生理條件下，adhB只有微弱的醛脫氫酶活性，adhE卻有很高的醛脫氫酶活性而沒有醇脫氫酶活性。通過實時定量PCR測定adhA、adhB和adhE基因的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果表明adhB和adhE的轉(zhuǎn)錄水平隨著乙醇濃度的增加逐步下降[25]。隨后試驗表明，在嗜熱厭氧桿菌中乙醇代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)受蛋白PAdhE-1和PAdhE-2（RSP）的調(diào)控[26]。

2.3 超嗜熱菌乙醇代謝途徑及其關(guān)鍵酶功能特性

研究表明超嗜熱古菌激烈火球菌和超嗜熱細(xì)菌新阿波羅棲熱袍菌可以產(chǎn)生少量乙醇或微量乙醇以及一些醋酸、乳酸、氫氣和二氧化碳[15，19]。對超嗜熱古菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的機(jī)理還不是很清楚。盡管超嗜熱菌基因組測序工作有了很大進(jìn)展，在已測序的超嗜熱菌基因組中還沒有發(fā)現(xiàn)編碼丙酮酸脫羧酶（PDC，可作用于丙酮酸形成二氧化碳和乙醛）的基因或是同源蛋白的基因[27]。此外，目前在超嗜熱菌基因組中也沒有發(fā)現(xiàn)AdhE的編碼基因，AdhE功能之一是催化乙酰輔酶A生產(chǎn)乙醛。在極端嗜熱菌如嗜熱厭氧乙醇桿菌JW200中發(fā)現(xiàn)，AdhB醇脫氫酶具有醛/醇脫氫酶雙功能活性，但是，目前研究的超嗜熱菌來源的醇脫氫酶并不具有醛/醇脫氫酶活性功能[28-31]。來源激烈火球菌的醇脫氫酶最適反應(yīng)溫度超過 95 ℃，需要輔酶NADP+和金屬離子Zn2+[29]。來源激烈火球菌的醇脫氫酶最適反應(yīng)溫度超過 95 ℃，最適反應(yīng)pH值為10.4，需要輔酶NADP+和金屬離子Zn2+[29]。來源激烈火球菌的醇脫氫酶最適反應(yīng)溫度超過 95 ℃，最適反應(yīng)pH值為10.4，需要輔酶NADP+和金屬離子Fe2+或Zn2+[29]。

迄今為止，在超嗜熱菌中沒有發(fā)現(xiàn)類似釀酒酵母和運動發(fā)酵單孢菌為代表的乙醇代謝途徑，即通過丙酮酸脫羧酶（PDC）和乙醇脫氫酶（ADH）將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醇，也沒有發(fā)現(xiàn)類似極端嗜熱厭氧乙醇桿菌為代表的乙醇代謝途徑（通過輔酶A-依賴型的乙醛脫氫酶（AdhE）轉(zhuǎn)化為乙醛，最后在乙醇脫氫酶（ADH）作用下生成乙醇的代謝途徑[27]。

人們從超嗜熱菌中分離純化了丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶（POR），并對POR進(jìn)行了酶學(xué)特性分析。1997年，在超嗜熱菌激烈火球菌中分離純化到的一個TPP-和CoA-依賴型丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶（POR），該酶具有雙功能活性，具有POR活性和PDC活性[32]。隨后在更多的超嗜熱菌中純化到丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶（POR）[32-34]。表2比較了多種生物中分離純化的丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶（POR）的特性。來源于超嗜熱菌激烈火球菌、海棲熱袍菌的丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶（POR）是一個雙功能的酶，該酶既具有PDC活性，又具有POR活性[35-36]。但是在生理條件下，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶（POR）是更傾向于將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，還是將丙酮酸直接轉(zhuǎn)化為乙醛，目前還不是很清楚。

3 嗜熱菌遺傳轉(zhuǎn)化體系

嗜熱菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與常溫菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)有差異。高溫條件下，大部分抗菌素會很快失效，一些抗藥基因編碼的蛋白質(zhì)也不夠穩(wěn)定。目前，嗜熱厭氧乙醇桿菌的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)建立[37]。運用超聲波技術(shù)后，嗜熱厭氧桿菌的基因轉(zhuǎn)化效率得到提高[38]。超嗜熱古菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展迅速[39-42]，營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記在超嗜熱古菌中得到應(yīng)用，構(gòu)建了乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶編碼基因pyrF缺陷型菌株激烈火球菌（P. furiosus COM1）[39]。嗜熱厭氧桿菌的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為研究胞內(nèi)基因功能的重要步驟。

4 存在的問題與展望

嗜熱菌具有廣泛的底物利用能力，可以利用纖維素、半纖維素、淀粉等多聚糖底物，也可以利用核糖、木糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖等發(fā)酵生產(chǎn)生物能源如乙醇和氫氣[7，11，15]。嗜熱菌高溫發(fā)酵的優(yōu)勢既可以抑制雜菌的生長，又可以提高化合物的分散度和溶解度，從而引起人們的極大興趣。目前面臨的主要問題包括嗜熱菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不夠穩(wěn)定、嗜熱菌代謝途徑及其調(diào)控機(jī)理不夠清晰。隨著合成生物學(xué)技術(shù)和基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，嗜熱菌的遺傳轉(zhuǎn)化和代謝途徑的改造提供了巨大的發(fā)展空間和機(jī)遇。

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