韓 笑，陸榮柱

食管癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)食管癌的發(fā)病率居全球之首，每年發(fā)病率和病死率均占全球發(fā)病率和病死率的一半以上。食管癌的5年生存率僅為10%，但早期食管癌的生存率可達(dá)90%[1]。所以“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”對(duì)于食管癌患者來說意義重大。ATM和p16基因均為抑癌基因，兩者通過特定途徑影響細(xì)胞周期，在食管癌的發(fā)生中起重要作用。本文采用免疫組化法檢測(cè)ATM和p16蛋白在早期食管癌組織及癌旁正常鱗狀上皮組織中的表達(dá)，探討兩者在早期食管癌發(fā)生中的作用及兩者的相關(guān)性，旨在為診斷早期食管癌提供新方法。

1 材料與方法

1.1一般資料選取淮安市腫瘤醫(yī)院2012年1月～2015年12月手術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)的早期食管癌患者69例，其中男性42例，女性27例，年齡46～78歲，平均62歲。所選取組織肉眼分型有糜爛型、斑塊型、隱伏型，以斑塊型為主；病理組織學(xué)類型均為鱗狀細(xì)胞癌，其中原位癌9例，黏膜內(nèi)癌22例，黏膜下癌38例，高分化23例，中分化30例，低分化16例；癌旁組織均為早期食管癌患者手術(shù)后大標(biāo)本的切緣組織，組織學(xué)上均為正常的鱗狀上皮組織。

1.2方法采用免疫組化SP法檢測(cè)ATM蛋白和p16蛋白的表達(dá)。免疫組化染色嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行，用PBS緩沖液作為一抗，作為陰性對(duì)照；用已知的陽性片作為陽性對(duì)照。ATM抗體購(gòu)自Abcam公司，p16抗體、SP試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3結(jié)果判定ATM蛋白和p16蛋白部分表達(dá)于細(xì)胞核，部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，鏡下細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。(1)按著色程度評(píng)分：無陽性染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為陰性(-)；1分以上為陽性(+～)，其中1、2分為(+)，3、4分為()，6～9分為()。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。ATM蛋白和p16蛋白表達(dá)與早期食管癌的臨床病理特征的研究采用χ2檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有計(jì)學(xué)意義。ATM蛋白和p16蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，r<1.0為兩者有相關(guān)性。

2 結(jié)果

本組實(shí)驗(yàn)中ATM蛋白和p16蛋白部分表達(dá)于細(xì)胞核，部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。69例早期食管癌組織中ATM蛋白陽性率為60.9%，p16蛋白陽性率為68.1%，兩者在早期食管癌組織中的表達(dá)均低于癌旁正常鱗狀上皮組織(圖1、2)，兩者表達(dá)與患者年齡、性別、腫塊位置無關(guān)(P>0.05)，與分化程度、浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05)，隨著分化程度的降低、浸潤(rùn)深度的加深，兩者表達(dá)均下降(表1)。實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)ATM蛋白和p16蛋白的表達(dá)有一定的相關(guān)性(r=0.598，表2)。

3 討論

ATM基因是肌醇激酶-3(Phosphatidylinostiol 3-kinase, PI3K)基因家族的成員，是一種腫瘤抑制基因[2]。由其編碼的ATM蛋白是一種自動(dòng)磷酸化蛋白[3]，主要存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。該蛋白最主要的功能區(qū)位于蛋白C末端，主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA損傷識(shí)別和修復(fù)[4]。DNA損傷誘導(dǎo)ATM激活，ATM通過磷酸和去磷酸化一系列蛋白底物如p53等參與細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的監(jiān)管和DNA損傷后修復(fù)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，使受損的DNA阻滯細(xì)胞周期的G1/S期、S期和G2/M期這3個(gè)檢測(cè)點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行修復(fù)。但當(dāng)ATM由于突變而造成功能受損時(shí)，細(xì)胞則喪失這一功能，不能對(duì)受損的DNA給予正常修復(fù)，這樣受損的DNA很容易隨細(xì)胞分裂而傳入子代細(xì)胞，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變。Seshagiri等[5]報(bào)道ATM蛋白和結(jié)腸癌也有一定的關(guān)系，Roberts等[6]報(bào)道ATM蛋白和胰腺癌有一定的關(guān)系，可見ATM蛋白在消化道腫瘤中起很大作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ATM在早期食管癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常鱗狀上皮組織，且其表達(dá)與組織分化程度、浸潤(rùn)深度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)隨著分化程度的降低、浸潤(rùn)深度的加深，ATM蛋白在早期食管癌組織中的表達(dá)越低。這說明當(dāng)ATM由于突變而造成功能受損時(shí)，不能對(duì)受損的DNA給予正常修復(fù)，使得受損的DNA很容易隨細(xì)胞分裂而傳入子代細(xì)胞，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變。表明ATM蛋白低表達(dá)在早期食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

表2 早期食管癌組織中ATM蛋白和p16蛋白表達(dá)的相關(guān)性

①②

圖1 ATM在早期食管癌中的表達(dá)，SP法圖2 p16蛋白在早期食管癌中表達(dá)，SP法

p16是一種非常重要的抑癌基因[7]，編碼表達(dá)一個(gè)含148個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。該蛋白可以特異性地與細(xì)胞周期素4(CDK4)結(jié)合，抑制CDK4的活性，從而使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在G1期，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制[8]。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，p16基因突變或甲基化后失去正常的蛋白表達(dá)功能，出現(xiàn)細(xì)胞周期素D與CDK4結(jié)合增加，使細(xì)胞增殖加速，最終演變?yōu)榧?xì)胞的生長(zhǎng)活動(dòng)失去控制。本組免疫組化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p16蛋白在早期食管癌組織中低表達(dá)，且其與組織分化程度、浸潤(rùn)深度有關(guān)，且隨著分化程度的降低、浸潤(rùn)深度的加深，在早期食管癌組織中的表達(dá)越低。這些均說明p16蛋白的低表達(dá)或表達(dá)缺失在早期食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要的促進(jìn)作用。Noushin等[9]研究發(fā)現(xiàn)在食管癌中p16蛋白表達(dá)也下降，還有研究發(fā)現(xiàn)p16蛋白表達(dá)缺失可能出現(xiàn)在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的早期階段[10]。

ATM和p16均為抑癌基因，可以使細(xì)胞周期停滯于G1期，使受損的DNA得到修復(fù)或者細(xì)胞生長(zhǎng)得以抑制。在食管鱗狀細(xì)胞癌中p16蛋白和多種蛋白相關(guān)性研究報(bào)道很多，趙醒等[11]報(bào)道p16蛋白和Cyclin D1的表達(dá)無明顯相關(guān)性，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在早期食管癌中p16蛋白和ATM蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.598)，兩者表達(dá)是否有高度相關(guān)或者顯著性相關(guān)，可能還要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)38例ATM蛋白和p16蛋白同時(shí)陽性者中有24例患者分化程度均為Ⅰ～Ⅱ級(jí)、浸潤(rùn)深度在黏膜層以上，這表明聯(lián)合檢測(cè)兩者的表達(dá)，對(duì)判斷早期食管癌的分化程度和浸潤(rùn)深度上有一定提示作用，這也間接表明兩者對(duì)預(yù)后有一定提示作用。

本組69例早期食管癌患者手術(shù)后均未行放、化療，有2例死于腦血管疾病，1例術(shù)后隨訪胸部X線發(fā)現(xiàn)肺部小粟粒狀陰影，拒絕進(jìn)一步檢查治療，所以不能確定是否是轉(zhuǎn)移灶。本組實(shí)驗(yàn)對(duì)ATM蛋白和p16蛋白在早期食管癌中的表達(dá)情況進(jìn)行觀察，旨在為診斷早期食管癌提供新的診斷思路和方向，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，對(duì)判斷早期食管癌的分化程度和浸潤(rùn)深度上有一定的提示作用。

[1] Ding G C, Ren J L, Chang F B,etal. Human papillomavirus DNA and p16INK4Aexpression in concurrent esophageal and gastric cardia cancers[J]. World J Gastroenterol, 2010,6(46):5901-5906.

[2] Kim H S, Choi S I, Min H L,etal. Mutation at intronic repeats of the ataxia-telangiectasia mutated (ATM) gene and ATM protein loss in primary gastric cancer with microsatellite instability[J]. PLoS One, 2013,8(12):e82769.

[3] Venturina S, Veronica O, Giulia F,etal. Tug of war between survival and death: exploring ATM function in cancer[J]. Int J Mol Sci, 2014,15(4):5388-5409.

[4] Chris T, Williamson, Huong M,etal. ATM-deficiency sensitizes mantle cell Lymphoma cells to PARP-1 inhibitors[J]. Mol Cancer Ther, 2010,9(2):347-357.

[5] Seshagiri S, Stawiski E W, Durinck S,etal. Recurrent r-spondin fusions in colon cancer[J]. Nature, 2012,488(7413):660-664.

[6] Roberts N J, Jiao Y, Yu J P,etal. ATM mutations in patients with hereditary pancreatic cancer[J]. Cancer Discov, 2012,2(1):41-46.

[7] Christine H C, Qiang Z, Christina S K,etal. p16 protein expression and human papillomavirus status as prognostic biomarkers of nonoropharyngeal head and neck squamous cell carcinoma[J]. J Clin Oncol, 2014,32(35):3930-3938.

[8] 王文普, 孫 紅. 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中p16和CXCR4的表達(dá)及意義[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2013,29(8):914-918.

[9] Noushin T, Firouzeh B, Masoud S,etal. p16INK4ahypermethylation and p53, p16 and MDM2 protein expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. BMC Cancer, 2010,10:138.

[10] Li J, Poi M J, Tsai M D. The regulatory mechanisms of tumor suppressor p16INK4Aand relevance to cancer[J]. Biochemistry, 2011,50(25):5566-5582.

[11] 趙 醒, 趙宇陽, 王 軍, 等. 食管鱗狀細(xì)胞癌中細(xì)胞周期素D1和p16蛋白的表達(dá)及意義[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2015,1(36):273-275.