郭智俊，彭桂香，張丹芳，鐘勝華，黃風(fēng)琴，劉 浩

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。尿液細(xì)胞學(xué)檢查是臨床上應(yīng)用廣泛且最有效的無(wú)創(chuàng)性膀胱癌診斷方法之一。其操作簡(jiǎn)易、快速，標(biāo)本取樣簡(jiǎn)便、容易，患者無(wú)損傷、無(wú)痛苦，并能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷膀胱癌，適合于大規(guī)模人群普查。但涂片法往往造成細(xì)胞不集中、量少，細(xì)胞易退變，易脫落，血尿標(biāo)本涂片常常出現(xiàn)細(xì)胞堆積、厚薄不一致，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及背景不清晰等現(xiàn)象，導(dǎo)致癌細(xì)胞低檢出率，使患者漏診人數(shù)增加。近年來(lái)，切片技術(shù)在脫落細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用，提高了腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性檢出率。關(guān)于胸腹水脫落細(xì)胞檢查的有關(guān)技術(shù)報(bào)道較多[1-4]，但未見(jiàn)尿脫落細(xì)胞切片的研究報(bào)道。作者在實(shí)際工作中經(jīng)過(guò)探索，借助胸腹水細(xì)胞切片的制做方法，設(shè)計(jì)了尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法，同時(shí)對(duì)尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法和涂片法在膀胱癌中的診斷價(jià)值進(jìn)行了對(duì)比分析，效果滿意，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1材料收集膀胱鏡活檢組織病理檢查確診為膀胱癌患者的尿液標(biāo)本71份，離心采用普通水平式離心機(jī)，脫水、包埋、切片、染色采用病理科的常規(guī)組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)和染色機(jī)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本處理 (1)非血性尿液標(biāo)本的處理：收到尿液標(biāo)本后自然靜止沉淀25 min，將容器底部60 mL左右的尿液分別倒入4個(gè)15 mL的離心管中，經(jīng)1 200 r/min離心沉淀5 min，把上清液棄去；然后將沉淀物集中收集到1只尖底塑料試管內(nèi)，經(jīng)1 500 r/min離心沉淀3 min，棄上清液，取少量沉淀物直接涂片2張，行常規(guī)HE染色，再在剩余的沉淀物中加入0.3%伊紅乙醇溶液(0.3 g醇溶性伊紅加入95%乙醇100 mL)0.5～1.5 mL，以1 500 r/min離心5 min，棄上清液，留下試管底部的沉淀物備用。加入0.3%伊紅乙醇溶液既能固定細(xì)胞，又能使沉淀物中的細(xì)胞著色，便于包埋和切片。(2)血性尿液標(biāo)本的處理：收到尿液標(biāo)本后自然靜止沉淀25 min，將容器底部60 mL左右的尿液分別倒入4個(gè)15 mL的離心管中，經(jīng)1 200 r/min離心沉淀5 min，把上清液棄去；然后將沉淀物集中收集到1只尖底塑料試管內(nèi)，經(jīng)1 500 r/min離心沉淀3 min，棄上清液，取少量沉淀物做直接涂片2張，常規(guī)HE染色，再在剩余的沉淀物中加入5%醋酸乙醇溶液(5 mL冰醋酸加入95%乙醇95 mL)0.5～1.5 mL，以1 500 r/min離心沉淀5 min，棄上清液，留下試管底部的沉淀物備用。5%醋酸乙醇溶液既可以固定細(xì)胞，又可以溶解血尿中的紅細(xì)胞。

1.2.2沉淀物瓊脂石蠟雙包埋處理 將4.5%瓊脂(稱取廣東汕頭市水產(chǎn)品綜合加工廠生產(chǎn)的瓊脂粉4.5 g倒入三角燒杯中，加蒸餾水100 mL加熱使瓊脂充分溶解，置63 ℃恒溫箱中保存?zhèn)溆?倒入預(yù)熱到63 ℃左右的包埋模子里，待溫度稍降，冷卻至瓊脂表面將要凝固時(shí)迅速將上述保留在管底備用的沉淀物注入瓊脂內(nèi)，即可形成有顏色(淡或暗紅色)的細(xì)胞團(tuán)塊。之后，待瓊脂自然冷卻凝固或可將石蠟包埋模子放在冰上以加速瓊脂凝固。取出瓊脂包埋好的細(xì)胞團(tuán)塊，用刀片切去細(xì)胞團(tuán)塊周?chē)嘤嗟沫傊?，使之成為小塊。較小的沉淀物周?chē)沫傊啥嘈?，以便于定位和操作。將?xì)胞團(tuán)塊放入已編號(hào)的組織脫水包埋盒中，置組織脫水機(jī)中按常規(guī)方法進(jìn)行脫水、透明、浸蠟，取出細(xì)胞團(tuán)塊按常規(guī)組織石蠟包埋方法進(jìn)行包埋。

1.2.3連續(xù)切片和染色 把細(xì)胞團(tuán)塊周邊的石蠟修掉，越小越好，3～4 μm厚連續(xù)切片，沉淀物少的標(biāo)本連續(xù)性切完。按常規(guī)方法脫蠟、HE染色、封片。

1.2.4尿脫落細(xì)胞診斷方法 由經(jīng)驗(yàn)豐富的腫瘤病理學(xué)專(zhuān)家對(duì)尿脫落細(xì)胞常規(guī)涂片和尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片做出診斷。診斷結(jié)果分為五級(jí)：Ⅰ級(jí)：未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞；Ⅱ級(jí)：查見(jiàn)核異質(zhì)細(xì)胞；Ⅲ級(jí)：查見(jiàn)可疑癌細(xì)胞；Ⅳ級(jí)：查見(jiàn)高度可疑癌細(xì)胞；Ⅴ級(jí)：查見(jiàn)癌細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)將Ⅰ～Ⅱ級(jí)定為陰性，Ⅲ～Ⅴ級(jí)定為陽(yáng)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法鏡下細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞集中，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，厚薄一致，圖像背景干凈(只是在細(xì)胞塊周?chē)晕⒖梢?jiàn)瓊脂痕跡)，易于觀察診斷(表1)。經(jīng)膀胱鏡活檢病理檢查確診為膀胱癌的71例尿液標(biāo)本中尿脫落細(xì)胞常規(guī)涂片法檢測(cè)出陽(yáng)性標(biāo)本51例，陽(yáng)性率為71.8%(51/71)，尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法檢測(cè)出陽(yáng)性標(biāo)本65例，陽(yáng)性率為91.5%(65/71)。尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法陽(yáng)性率明顯高于尿脫落細(xì)胞常規(guī)涂片法(P<0.01，表2)。尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法癌細(xì)胞的檢出率顯著高于尿脫落細(xì)胞常規(guī)涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 兩種方法細(xì)胞形態(tài)及制片質(zhì)量比較

表2 兩種方法檢測(cè)膀胱癌的結(jié)果比較

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是泌尿外科的常見(jiàn)病之一。尿路上皮癌是其最為常見(jiàn)的病理類(lèi)型，占膀胱腫瘤的90%～95%，其余5%～10%是間葉性腫瘤和其他罕見(jiàn)型上皮性腫瘤[5]。近年來(lái)，膀胱癌的發(fā)病率和病死率逐年上升[6-7]。全球每年約35.6萬(wàn)新增病例，發(fā)病率位居所有腫瘤的第9位[8]。男性發(fā)病率是女性的3倍。在美國(guó)，膀胱尿路上皮癌位居男性最常見(jiàn)癌癥的第4位，在女性中位居第8位[9]。膀胱癌的發(fā)病和吸煙有關(guān)，也和各種環(huán)境及職業(yè)的化學(xué)物質(zhì)接觸有關(guān)。膀胱癌的發(fā)病機(jī)制包括復(fù)雜的多種基因變化[10]。隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程加快、吸煙人數(shù)增加以及環(huán)境污染不斷加重，膀胱腫瘤患者數(shù)量也呈逐漸增加趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)人膀胱癌的發(fā)病率在60歲以后超過(guò)腎腫瘤，居中國(guó)泌尿系惡性腫瘤發(fā)病的第1位[11]。惡性度高、術(shù)后易復(fù)發(fā)[12]是膀胱癌的主要臨床特點(diǎn)。約70%患者起病時(shí)表現(xiàn)為淺表性病變，復(fù)發(fā)率高達(dá)60%～85%，10%～20%最終發(fā)展為浸潤(rùn)性癌或轉(zhuǎn)移性癌[13-15]，因此，對(duì)膀胱癌的早期診斷以及對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)非常重要。2001年由美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的運(yùn)用FISH探針來(lái)識(shí)別膀胱癌的畸變?nèi)旧w，其靈敏度明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，是目前診斷和發(fā)現(xiàn)膀胱癌很有價(jià)值的無(wú)創(chuàng)方法，但國(guó)內(nèi)FISH技術(shù)仍處于臨床研究階段，靈敏度和特異性與國(guó)外也多有不同[16]。而且FISH檢測(cè)費(fèi)用昂貴、所需設(shè)備及技術(shù)要求高、操作流程復(fù)雜，不適于大規(guī)模人群普查。許多學(xué)者通過(guò)多種尿液腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)間接診斷膀胱癌，但均存在一定的缺陷，傳統(tǒng)的膀胱鏡和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查仍是目前臨床上診斷、隨訪膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)[17-18]。膀胱鏡檢查具有較高的敏感性和特異性，但其為有創(chuàng)檢查，患者痛苦，花費(fèi)較高，患者難以接受[19-20]，而且觀察范圍有限，可能會(huì)遺漏位于難以窺視部位的腫瘤。同時(shí)，膀胱鏡的有創(chuàng)檢查可能導(dǎo)致尿道感染性疾病的發(fā)生，因此膀胱鏡難以作為普查手段。在無(wú)創(chuàng)篩查手段中，尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查是目前臨床泌尿系腫瘤的有效篩查手段[21]，尿脫落細(xì)胞學(xué)涂片檢查具有高特異性，其操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，標(biāo)本來(lái)源容易，患者無(wú)痛苦、無(wú)損傷，并能早期發(fā)現(xiàn)早期診斷膀胱癌，患者容易接受，適合于大規(guī)模人群普查，但其敏感性較低[22-23]，易漏診。導(dǎo)致其敏感性低的原因主要由于尿脫落細(xì)胞學(xué)涂片法只能取少量沉淀物涂片，而且涂片范圍大，細(xì)胞不集中、量少，鏡下觀察費(fèi)時(shí)、易漏診；同時(shí)涂片法細(xì)胞固定較困難，如果直接將玻片放入95%乙醇內(nèi)固定，會(huì)造成大多數(shù)細(xì)胞脫落，如果干燥后再固定，細(xì)胞易退變，細(xì)胞核模糊不清，易誤診。血尿標(biāo)本涂片常常出現(xiàn)細(xì)胞堆積、厚薄不一致，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及背景不清晰等現(xiàn)象。從而導(dǎo)致癌細(xì)胞檢出率低，使患者漏診人數(shù)增加。因此探索一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、適用于普查手段兼顧敏感性和特異性的無(wú)創(chuàng)檢查方法十分必要。筆者借助胸腹水細(xì)胞切片的制做方法。設(shè)計(jì)了尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法，并與涂片法對(duì)比，取得了滿意的效果。尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法可避免上述缺點(diǎn)。尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋切片提高了尿脫落細(xì)胞檢查的制片質(zhì)量，鏡下細(xì)胞厚薄一致，呈薄片狀排列、形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰。同時(shí)，該方法幾乎能將送檢尿液標(biāo)本中的所有脫落細(xì)胞收集起來(lái)，使被檢細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而且細(xì)胞集中，密度高，便于觀察診斷，從而可減少漏診，提高陽(yáng)性細(xì)胞的檢出率。王蓉等[24]報(bào)道，連續(xù)切片法可顯著提高癌周淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移的檢出率和可信度，特別是對(duì)于常規(guī)切片法一個(gè)切面容易漏診的微小轉(zhuǎn)移灶能明顯提高檢出率，是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的病理組織學(xué)方法。王春建等[25-26]研究結(jié)果也證實(shí)連續(xù)病理切片后HE染色能提高乳腺癌前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢出率。本組實(shí)驗(yàn)借助組織學(xué)連續(xù)切片法可保證切片時(shí)各細(xì)胞及碎小組織完整切出，從而進(jìn)一步提高陽(yáng)性細(xì)胞的檢出率。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，尿脫落細(xì)胞常規(guī)涂片法陽(yáng)性率為71.8%，尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法陽(yáng)性率為91.5%，尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法癌細(xì)胞檢出率明顯高于尿脫落細(xì)胞常規(guī)涂片法(P<0.01)。 本組實(shí)驗(yàn)采用將細(xì)胞沉淀物注入包埋模子里的瓊脂內(nèi)，比將瓊脂加入離心管內(nèi)與細(xì)胞沉淀物混合的方法操作更方便，可避免瓊脂在與細(xì)胞混合前受冷凝固的問(wèn)題。值得注意的是，瓊脂需要冷卻且在沒(méi)有凝固之前將細(xì)胞注入，溫度過(guò)高，細(xì)胞受熱會(huì)影響細(xì)胞形態(tài)；溫度過(guò)冷，瓊脂凝固狀態(tài)時(shí)難以將細(xì)胞注入進(jìn)去。

膀胱癌早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)是提高診治的關(guān)鍵。尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法是一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、適用于普查手段兼顧敏感性的無(wú)創(chuàng)檢查方法。該方法將有助于早期診斷、術(shù)后監(jiān)測(cè)膀胱癌，提高膀胱癌患者生存率、改善預(yù)后，在臨床上有較高的應(yīng)用價(jià)值，值得普及推廣應(yīng)用。

[1] 郭智俊. 胸腹水沉淀物瓊脂石蠟雙包埋切片法[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 1995,11(1):65.

[2] 郭智俊, 彭掛香, 潘乃梁. 胸腹水沉淀物瓊脂石蠟雙包埋切片法與常規(guī)涂片法的對(duì)比[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2002,18(4):437.

[3] 賀海燕, 李永紅, 張 淼, 等. 瓊脂、石蠟雙包埋法及免疫細(xì)胞化學(xué)在胸腹水沉積物切片診斷中的應(yīng)用[J]. 寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007,29(5):496-497.

[4] 劉 巖, 吳秉銓, 鐘鎬鎬. 等. 瓊脂石蠟雙包埋和免疫細(xì)胞化學(xué)染色的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用[J]. 診斷病理學(xué)雜志, 2013,20(3):184-186.

[5] 張兆祥, 劉宇飛. 尿路上皮癌組織學(xué)變異型的病理特征及診斷[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2008,24(6):729-734.

[6] Altieri V M, Castellucci R, Palumbo P,etal. Recurrence and progression in non-muscle-invasive bladder cancer using EORTC risk tables[J]. Urol Int, 2012,89(1):61-66.

[7] Ploeg M, Aben K K, Kiemeney L A. The present and future burden of urinary bladder cancer in the world[J]. World J Urol, 2009,27(3):289-293.

[8] YaKasai A, Allam M, Thompson A J,etal. Incidence of bladder cancer in a one-stop clinic[J]. Ann Afr Med, 2011,10(2):112-114.

[9] Jemal A, Siegel R, Xu J,etal. Cancer statistics, 2010[J]. CA Cancer J Clin, 2010,60(5):277-300.

[10] Al Hussain T O, Akhtar M. Molecular basis of urinary bladder cancer[J]. Adv Anat Parhol, 2013,20(1):53-60.

[11] 韓蘇軍, 張思維, 陳萬(wàn)青, 等. 中國(guó)膀胱癌發(fā)病現(xiàn)狀及流行趨勢(shì)分析[J]. 癌癥進(jìn)展, 2013,11(1):89-95.

[12] Sylvester R J. How well can you actually predict which non-muscle-invasive bladder cancer patients will progress?[J]. Eur Urol, 2011,60(3):431-433.

[13] Lee R, Droller M J. The natural history of bladder cancer. Implications for therapy [J]. Urol Clin North Am, 2000,27(1):1-13.

[14] Dalbagni G, Herr H W. Current use and questions concerning intravesical bladder cancer[J]. Urol Clin North Am, 2000,27(1):137-146.

[15] Sexton W J, Wiegand L R, Correa J J,etal. Bladder cancer：a review of non-muscle invasive disease[J]. Cancer Control, 2010,17(4):256-268.

[16] 袁曉亮, 甘衛(wèi)東, 姚林方, 等. 熒光原位雜交技術(shù)在膀胱尿路上皮癌診斷中的臨床應(yīng)用[J]. 中華腔鏡泌尿外科雜志, 2012,6(1):44-47.

[17] 劉彩樹(shù), 蔡 森, 張亞萍, 等. 膀胱癌尿液生物標(biāo)志物的現(xiàn)狀與展望[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2015,46(4):255-258.

[18] 王友寶, 張 梁, 韓 韜, 等. 膀胱癌患者尿液中miR-126、miR-152的表達(dá)水平及臨床意義[J]. 現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志, 2016,8(2):102-105.

[19] 徐躍文, 張 超, 桂俊卿, 等. 膀胱腫瘤細(xì)胞體外侵襲過(guò)程的掃描電鏡觀察[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào), 2011,24(5):453-455.

[20] Tschirdewahn S, Vom Dorp F. Diagnostics of nonmuscle-in-vasive urothelial cell carcinoma of the bladder[J]. Urologe A, 2015,54(4):480-483.

[21] Milicic V, Prvulovic I, Panda N,etal. Diagnostic value of cytology of voided urine[J]. Coil Antropol, 2014,38(2):617-620.

[22] Urquidi V, Rosser C J, Goodison S. Multiplex urinary tests for bladder cancer diagnosis[J]. Eur Med J Urol, 2013,1:70-73.

[23] 江長(zhǎng)琴, 梁朝朝, 施浩強(qiáng), 等. NMP22聯(lián)合FISH技術(shù)在血尿患者膀胱癌篩查中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志, 2015,7(1):57-62.

[24] 王 蓉, 李華良, 黃信章. 連續(xù)切片法檢測(cè)癌周淋巴結(jié)的意義[J]. 南京部隊(duì)醫(yī)藥, 2002,4(3):27-28.

[25] 王春建, 穆殿斌, 王永勝, 等. 連續(xù)切片檢測(cè)乳腺癌前哨淋巴結(jié)隱性轉(zhuǎn)移研究[J]. 中國(guó)腫瘤外科雜志, 2009,1(3):148-151.

[26] 錢(qián)立宇, 錢(qián) 軍, 馬 莉, 等. 連續(xù)病理切片檢測(cè)乳腺癌前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的研究[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014,45(5):434-437.